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作为机体抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线,天然免疫在保护机体健康方面发挥了重要作用。其主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)对病原微生物高度保守的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPS)进行识别,诱导干扰素产生,发挥抗病毒效应进而保护机体健康。RIG-I样受体(RIG-I-like receptor,RLR)家族是一类重要的胞质PPRs,该家族由维甲酸(视黄酸)诱导基因I(Retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)和遗传学与生理学实验室蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)三个成员组成。MDA5和RIG-I能够识别不同类型的病毒RNA,产生抗病毒作用。LGP2由于缺少CARD区,起着调控RIG-I和MDA5的活性的作用。与哺乳动物不同,鸡天然缺失RIG-I。对鸡而言MDA5在抗病毒天然免疫过程中的作用极为重要。目前对于哺乳动物MDA5的研究有很多,但是关于鸡MDA5介导的信号传导途径及其调控机制的研究仍有很大空缺。本研究通过质谱鉴定和二代测序两种技术方法,从蛋白质和m RNA水平,对鸡MDA5介导的信号传导途径及其调控机制进行了研究。研究结果如下:1.鸡MDA5互作蛋白的鉴定及其调控鸡IFN-β产生的机制研究通过GST-pull down结合质谱分析的方法,鉴定到336个可能与鸡MDA5互作的蛋白。GO和KEGG分析后发现,这些互作蛋白在分子生物功能上主要与杂环化合物结合、蛋白质结合、离子结合等有关。互作网络分析发现这些互作蛋白主要涉及到溶酶体、剪接酶体、RNA转运、蛋白质加工等途径。我们从鉴定到的互作蛋白中克隆到60个基因,研究了这60个基因对鸡IFN-β启动子活性的影响。接着选取了在鸡MDA5-N和鸡MDA5两种刺激下都能影响鸡IFN-β的启动子活性的10个基因(鸡DDX5、EEF1A1、RBM39、PABPC1、HSPA5、HSPA8、HSP70、hn RNPH2、IFIT5、PRDX1),探究这些基因对鸡IFN-β产生的影响。CO-IP和IFA实验结果表明鸡DDX5、HSPA8、HSP70、hn RNPH2、IFIT5、PRDX1这6个蛋白与鸡MDA5-N互作。通过进一步对鸡hn RNPH2蛋白研究发现,鸡hn RNPH2减弱鸡MDA5与鸡MAVS的互作,抑制鸡IFN-β产生。2.过表达鸡MDA5和双链RNA模拟物poly(I:C)刺激的DF1细胞转录组测序分析对测序数据进行生物信息学分析,筛选差异表达基因,发现过表达鸡MDA5后的DF1细胞中差异表达基因有1007个,其中737个上调基因,270个下调基因;poly(I:C)刺激后的DF1细胞中差异表达基因745个,其中405个上调基因,340个下调基因。两种不同情况下都差异表达的基因有85个,其中62个上调基因,23个下调基因。对差异表达基因进行通路富集分析发现,过表达鸡MDA5组中差异表达基因富集分析排名前20个通路中多数与免疫相关,poly(I:C)刺激组中差异表达基因富集分析排名前20个通路与生物合成和代谢以及流感病毒感染等有关。接着我们选取了在两种不同情况下都上调表达的9个基因(鸡MX1、IFI6、IFIT5、RSAD2、OASL、CMPK2、HELZ2、EPSTI1和OLFML1),通过Real-time PCR验证了转录组数据的可靠性。进一步研究发现鸡MX1、IFI6、IFIT5、RSAD2和OASL抑制流感病毒H5N6感染DF1细胞。本研究不仅加深了对鸡MDA5信号传导调控机制的理解,也为鸡的抗病毒研究奠定理论基础。