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背景精神性疾病常伴随免疫-神经-内分泌系统的表达异常,激活外周单核细胞/巨噬细胞和精神性疾病相关的大脑内小胶质细胞,使体内炎性因子表达水平异常增高,而研究发现在抑郁症患者体内发现小胶质细胞炎性活化,且小胶质细胞炎性活化伴随丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)、丝裂原蛋白活化激酶(MAPKs)、NF-κB-P65信号通路改变。本实验以BV-2小胶质细胞为研究对象,利用脂多糖(LPS)和MKP-1抑制剂(Ro-318220)诱导BV-2小胶质细胞构建炎性模型,通过检测MKP-1蛋白及基因的表达、MAPKs、NF-κB-P65信号通路蛋白及小胶质细胞炎性水平的变化,探索MKP-1的表达变化对小胶质细胞炎性活化水平的影响及机制。目的探究LPS炎性诱导BV-2小胶质细胞并给予Ro-318220,检测MKP-1、NF-κB-P65信号通路蛋白、MAPK家族蛋白与小胶质细胞炎性活化的关系及机制,以明确MKP-1是否通过MAPK家族蛋白、NF-κB-P65信号通路引起小胶质细胞炎性活化,希望为抑郁症神经炎症假说提供依据。方法1.实验分组BV-2小胶质细胞分为Control组、Ro-318220(Ro)组、LPS组、LPS+Ro-318220(LPS+Ro)组。2.处理方法BV-2小胶质细胞给予LPS(1ug/ml)制造炎性模型,给予不同浓度Ro-318220抑制MKP-1的表达。3.应用免疫印迹法(Western blotting)检测四组BV-2小胶质细胞内MKP-1、P-ERK、P-JNK、P-P38、ERK、JNK、P38、及P-P65、P65等蛋白表达。4.应用免疫荧光技术检测各组BV-2小胶质细胞内钙结合蛋白-1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)的表达。5.应用荧光定量PCR(Quantitative RT-PCR)验证各组BV-2小胶质细胞中各炎性因子基因表达变化。6.应用ELISA验证各组BV-2小胶质细胞中各炎性细胞因子的表达变化。7.统计方法计量资料统计分析采用均数±标准差(x±S)表示,多组之间的比较使用单因素方差分析进行,两组之间比较进行统计分析采用独立样本t检验,采用双侧检验,用P<0.05表达有统计学意义的。结果1.不同条件下检测BV-2小胶质细胞中MKP-1的表达水平。(1)随着Ro-318220(0uM、2.5uM、5uM、10uM)药物浓度的增加,小胶质细胞中MKP-1表达逐渐降低,当药物浓度达到5uM、10uM时,BV-2小胶质细胞中MKP-1表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)当Ro-318220(10uM)作用BV-2小胶质细胞3h后,BV-2小胶质细胞中MKP-1表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)当LPS(1ug/ml)诱导BV-2小胶质细胞(0、30min、1h、3h、6h、12h、24h),在1h时BV-2小胶质细胞中MKP-1的蛋白表达水平达到最高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.LPS诱导BV-2小胶质细胞活化标志物的影响经LPS诱导BV-2小胶质细胞1h后,与Control组比较,Ro组染色较弱,LPS组染色较强。与LPS组比较,LPS+Ro组染色强度降低,说明Iba-1的表达有差异。3.免疫印迹(western blot)检测MAPK信号通路结果(1)MKP-1蛋白水平的影响:与Control组比较,LPS组MKP-1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),与LPS组比较,LPS+Ro组MKP-1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与Control组比较,Ro组基因表达水平降低、LPS组MKP-1基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),与LPS组比较,LPS+Ro组MKP-1基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)P-P38/P38蛋白水平的影响:Control组、Ro组、LPS+Ro组之间P-P38/P38蛋白表达水平无显著差异。与LPS组比较,LPS+Ro组内P-P38/P38蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)P-JNK/JNK蛋白水平的影响:与Control组比较,Ro组P-JNK/JNK蛋白水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+Ro组内P-JNK/JNK蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)P-ERK/ERK蛋白水平的影响:与Control比较,Ro组P-ERK/ERK蛋白水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Ro组、LPS组、LPS+Ro组P-ERK/ERK蛋白水平无显著差异。4.P-P65/P65蛋白水平的影响:与Control组比较,Ro组内小胶质细胞中P-P65/P65蛋白表达水平降低,LPS组小胶质细胞中P-P65/P65蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+Ro组内P-P65/P65蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5.实时荧光定量PCR检测炎性因子,与Control组比较,Ro组内小胶质细胞IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、COX-2基因表达水平降低,LPS组小胶质细胞中IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、COX-2基因表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+Ro组内IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、COX-2基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.ELISA检测炎性因子,与Control组比较,Ro组内小胶质细胞IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、分泌水平降低,LPS组小胶质细胞中IL-6、IL-1β、TNF-ɑ分泌水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+Ro组内IL-6、IL-1β、TNF-ɑ分泌水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.MKP-1可能是神经炎症发生的一个重要基因。2.MAPK-P38、JNK、NF-κB-P65信号通路可能与神经炎症发病机制有关。3.MKP-1可能通过P38、JNK、NF-κB-P65信号通路影响神经炎症因子的改变。