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构树(Broussonetia papyifera)是具有良好综合价值的与重金属污染修复有关的经济植物,目前有关构树响应重金属镉(Cd)胁迫的研究较少。对湖南湘潭尾矿区植被调查发现,构树是其重要的抗性植被资源。本研究对来源于湘潭尾矿区的构树资源进行优选,获得了在发芽、生理等相关方面具有良好表现的优株作为研究材料,开展构树抗Cd相关研究,结果如下:通过对构树优株进行消毒灭菌后获得其无菌苗,并进一步构建了构树组培体系。对构树组培苗在无菌及土壤栽植条件下进行不同浓度不同时间的CdC12胁迫,分析构树响应Cd胁迫的生理变化。结果发现,构树在Cd胁迫下其活性氧(ROS)大量积累、膜脂过氧化加剧、细胞渗透增强、脯氨酸含量增加、抗氧化酶(SOD、POD、GST等)活性增强,表明构树Cd胁迫响应生理涉及ROS代谢、抗氧化酶系统反应、脯氨酸代谢等重要过程。通过综合分析不同Cd胁迫浓度和时间下的生理响应,可知6月大构树较适合使用500 μM CdC12胁迫120 h来进行相关分析。因此,以0 h为对照,在此胁迫处理下通过Illumina HiSeq方法测定了构树根和叶的转录组,总共获得180,678,660bp(27.1G)净读数并被组装成589,487个高质量unigenes,其中256,025和250,251个分别在GO和PFAM被注释。总计24,414个差异表达基因(DEGs)被GO注释,且117,547个KEGG注释的DEGs被至少归为47个KEGG途径。筛选出与构树Cd响应相关的诸多转录因子(AUX/IAA、ARF、bHLH、bZIP、GRAS、NAC、MYB、WRKY、AP2/EREBP 等)和蛋白(SOD、POD、V-ATPase、GST、Lea、PPO等)。同时,可知构树Cd胁迫调控涉及较多信号通路,如ABA、MAPK、Ca2+、SOS等;且与苯丙素生物合成、植物激素信号转导和谷胱甘肽代谢等途径具有重要关系,这不仅为构树逆境机制研究提供了一个较为丰富的基因序列资源,也为研究构树及其镉应答机制和分子生物学提供了重要候选基因。同时,这有助于阐明构树的Cd胁迫响应分子机制,并通过培育新的耐逆品种促进重金属污染区的生物修复。为进一步研究构树Cd胁迫响应分子机制,从构树转录组中深入筛选MYB类转录因子进行分析,综合筛选出38个具有完整ORF的MYB转录因子,经表达及BLAST等多重分析,从中获得18个R2R3-MYB基因。这18个基因在不同时间(0、3、6、12、24、48h)的CdCl2处理下表现出较强的转录表达水平,且具有表达的时序性和根、茎、叶表达组织特异性。表明,构树R2R3-MYB在镉胁迫响应调节中具有良好的应答潜力,具有良好的研究价值和前景。对18个R2R3-MYB基因的表达水平进行聚类,综合分析发现BpTT2和BpMYB6具有较高的表达水平。因此,选择BpTT2和BpMYB6基因为代表,对R2R3-MYB的抗Cd功能进行分析。分别构建BpTT2和BpMYB6基因的植物过表达载体,并分别将二者在构树中过量表达,通过与非转化株系(NT)和空载体转化株系(CK)比较,分析BpTT2和BpMYB6基因调控Cd胁迫响应的功能。结果显示,BpTT2和BpMYB6基因的过量表达均能通过调节植株在Cd胁迫下的ROS代谢、抗氧化酶活性、多酚物质积累、脯氨酸代谢、细胞稳定和膜脂化来改善植株的抗Cd能力。通过分析下游防卫反应相关基因在BpTT2和BpMYB6基因过量表达株系中的转录水平,发现BpTT2和BpMYB6基因的高水平表达能有效提高下游BpSOD1、BpSOD2、BpPOD1、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpAPX-1、BpLEA、BpPP1、BpSDH1、BpALDH、BpCHS1、BpFLS、BpDFR1 等基因的转录。表明,在构树Cd胁迫响应调控中,BpTT2和BpMYB6基因主要通过调控下游相关基因来提高植株的抗氧化酶活性、多酚物质积累、谷胱甘肽及脯氨酸代谢等以增强植株的ROS清除能力、减缓细胞膜脂化和细胞受损程度,进而达到改善抗镉胁迫的效果。通过分析下游防卫反应在BpTT2和BpMYB6基因过量表达株系中的具体转录水平及相关的具体生理指标,可知BpTT2和BpMYB6在调控构树Cd胁迫响应中的具体表现不同。整体上,BpTT2 对飞游 BpSOD2、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpFLS、BpDFRl、BpLea、BpPP1、BpSDH1等基因的调控水平比BpMYB6基因要强。同时,BpTT2对下游BpGSTU、BpLea、BpDFR1、BpGPX、BpPP1、BpSDH1等基因的表达调控较强;而BpMYB6基因对BpPOD1、BpSOD1、BpGSTU8、BpGPX、BpAPX-1、BpSOD2 等基因的表达调控强于其他基因,这不仅体现了BpTT2和BpMYB6基因在调控Cd胁迫抗逆性上的差异性,也表明BpTT2调控Cd响应中谷胱甘肽代谢、膜脂稳定、多酚类物质代谢等途径更为突出;而BpMYB6基因调控Cd响应与抗氧化系统代谢更相关。综上,本研究系统的筛选了尾矿区构树优株并建立组培体系,在此基础上开展了构树Cd胁迫生理评价和转录组分析,获得了大量构树Cd响应相关基因资源和代谢途径,并筛选了其中重要的一类转录因子MYB,进一步对R2R3-MYB基因的Cd响应表达模式进行了分析,从中筛选出具有代表性的BpTT2和BpMYB6基因进行抗Cd功能研究。结果表明BpTT2和BpMYB6基因的过量表达均能有效改善构树的抗Cd能力,且涉及不完全相同的调控途径。这为后续开展构树Cd及重金属响应分子机制提供了重要的候选基因资源,也为耐逆品种选育以促进重金属污染区的生物修复打下了良好基础。