西甜瓜转基因抗病毒研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangbohan1991
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西甜瓜是我国重要的葫芦科作物,其栽培面积和消费总量位居世界蔬菜水果前列。病毒病是葫芦科作物生产中存在的重大问题,严重影响着西瓜和甜瓜的产量与品质。病毒病大面积爆发时,导致产量降低,甚至绝产。通过转基因手段,将病毒的相关基因通过农杆菌介导的遗传转化方法导入西瓜和甜瓜,探讨病毒与葫芦科寄主作物之间的关系,创制新的抗病毒葫芦科作物新种质,具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究的主要结果如下:1.优化了西瓜的组织培养体系。西瓜离体继代培养过程中,西瓜组培苗容易黄化,随着继代时间的延长,逐渐衰老死亡。本研究发现,Fe盐对黄化的影响最大,将Fe-EDTA浓度加倍,组培苗生长健壮,可以持续继代。西瓜继代苗根数少,清洗琼脂时,容易断根。将伸长至2-3cm的西瓜小植株,切下作为接穗,嫁接到两片子叶完全展开的砧木上,不仅能提高成活率,而且西瓜植株生长健壮,果实提早成熟一个月。解决了西瓜再生苗黄化和移栽成活率低的问题,为西瓜转基因技术奠定了好的基础。2.建立了西瓜的遗传转化体系。西瓜种子在1/2 MS培养基上萌发4-5d,子叶颜色从黄色刚刚转变为绿色作为外植体,切除生长点的子叶基端接种在培养基MS+BA 1.0mg/L预培养5d,农杆菌侵染20 min,共培养5d。转基因材料通过PCR和Southern杂交检测,初步验证基因整合到西瓜基因组。3.人工小RNA能够结合病毒RNA并降解其基因组,对病毒产生抗性。本研究利用人工小RNA技术设计的人工小RNA,可以识别黄瓜花叶病毒CMV 2a/2b基因部分编码区对CMV病毒进行基因表达抑制。转化西瓜材料,接种后,转基因株系通过ELISA检测,初步验证表达人工小RNA的转基因西瓜材料对CMV病毒具有抗性。4.建立了甜瓜遗传转化体系。甜瓜子叶颜色由黄色转为绿色时作为外植体,距下胚轴1-2mm处,切下子叶基端在培养基MS+BA 1.2mg/L中预培养5d,与农杆菌侵染20min,共培养3d。通过PCR和Southern杂交检测,以及GUS染色,进一步证明甜瓜转基因技术稳定。5.具有发卡结构的植物表达载体导入植株,在植物体内表达能够诱导基因沉默,协同发挥抗病机制。本研究构建ZYMV、WMV和CMV的3个外壳蛋白基因嵌合片段(CWZ)反向重复植物表达载体,利用农杆菌介导法转化常规甜瓜品种,将三种病毒的基因片段整合到甜瓜基因组,为探讨转基因葫芦科作物通过RNA沉默实现抗病毒提供了新的方法。本研究为葫芦科作物转基因技术提供了一些新的手段和方法,获得了转基因抗病毒的西瓜和甜瓜材料,具有一定的应用价值。
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