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羊巴贝斯虫病(Ovine babesiosis)是由媒介蜱传播的一种血液原虫病,患病动物临床表现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿等症状,严重感染时可引起死亡。现已报道并公认的病原主要有绵羊巴贝斯虫(Babesia ovis)、莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和粗糙巴贝斯虫(B.crassa)。我国羊巴贝斯虫病分布广泛,严重危害养羊业的健康持续发展。血小板反应蛋白相关匿名蛋白(TRAP)是由微线体分泌的蛋白,在顶复门原虫入侵宿主细胞过程中起重要作用,TRAP蛋白不仅是顶复门寄生虫滑动体的组件蛋白,参与该寄生虫的运动,而且当寄生虫与宿主细胞接触时,TRAP的胞外部分与宿主细胞表面受体结合,介导虫体黏附、定位和入侵宿主细胞。本研究通过克隆我国分离的2种6株羊巴贝斯虫trap基因全长,分析其结构特征,并以其为靶基因对我国羊巴贝斯虫的分类关系进行分析;表达重组TRAP蛋白,测定其反应原性;建立多重PCR检测方法,并应用该方法对我国9省采集的羊血样进行检测。目的是为了阐明羊巴贝斯虫trap基因结构,测定其作为免疫学和分子诊断靶标的可能性,同时为进一步确认我国羊巴贝斯虫的分类关系和该病在我国的流行状况提供基础数据。现将研究内容总结如下:1.通过动物感染试验,获得6株羊巴贝斯虫的阳性血清、纯化的裂殖子、基因组DNA等标准样品。克隆其trap基因的全长序列,生物信息学分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的结构特征;并以其为靶标分子,对我国羊巴贝斯虫的分类地位进行分析。结果显示,我国分离的羊巴贝斯虫存在两个种,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫;而莫氏巴贝斯虫内可以分为两个亚种,代表株分别为河北株/宁县株和临潭株/天祝株。该研究结果为开展巴贝斯虫trap基因的功能和厘清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供了依据。2.以莫氏巴贝斯虫临潭株和羊巴贝斯虫未定种新疆株为研究对象,分别从其cDNA中成功扩增trap基因全长,构建原核表达载体p ET-30a-BLTtrap和pET-30a-BXJtrap,转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,表达和纯化重组蛋白rBm TRAP和rBspTRAP,进行质谱鉴定和反应原性分析。结果显示该基因在大肠杆菌中被正确表达,rBmTRAP和rBsp TRAP大小分别为130ku和110ku;纯化后的蛋白浓度分别达到125μg/m L和100μg/m L。Western-blot和ELISA试验结果均表明rBspTRAP与rBm TRAP具有良好的反应性和特异性,与其他羊梨形虫和无浆体无交叉反应;用ELISA测定实验感染羊的血清中抗TRAP蛋白抗体滴度的试验结果显示,感染后羊体内抗TRAP蛋白的抗体滴度较低。结果表明TRAP可能不适合作为靶标蛋白建立羊巴贝斯虫血清学检测方法,也可能是由于本研究并未筛选到最佳ELISA反应条件导致,我们将在将来的研究中进行进一步确认。3.以6株羊巴贝斯虫trap基因为靶基因,设计合成三对特异性引物。通过条件优化,建立可用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株三个(亚)种虫株混合感染的多重PCR检测方法。该多重PCR方法与其他羊的巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体无交叉反应,最低可检测到10-100pg的羊巴贝斯虫基因组DNA。以所建的多重PCR方法对实验室感染的样品和采自我国甘肃、新疆等9省份的976份野外样品进行检测,结果显示,羊巴贝斯虫未定种平均阳性率为0.82%,而莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为1.02%。