最近几十年的研究显示,低温和各种其他刺激会引起不同形式的细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i)的增加。考虑到动物以Ca²⁺通道作为温度感受器,低温诱导的([Ca²⁺]_i)增加已被广泛推测参与植物低温胁迫。然而,相应的Ca²⁺通道的分子本质至今仍不能完全解释清楚。Ca²⁺作为第二信使,在整个植物细胞生理过程和响应外界刺激过程中都作为一个非常重要的调控因子,位于复杂信号通路网络的核心地位。植物活细胞能够通过复杂的钙信号通路感知和响应不同的环境信号,但是由于在长期进化过程中感受蛋白的功能冗余,或某个基因是植物生长发育进程中所必需的,而功能缺失导致突变体将不会存活等原因,进而导致到目前为止只克隆到了少数几个植物的胁迫感受器。本课题组所在实验室已具备成熟的技术和较先进完备的系统,我们已经在模式植物拟南芥中鉴定并克隆到渗透感受器OSCA1,并在此基础上,我们继续利用正向遗传学的方法进行筛选研究,期望我们能够有较高的概率识别植物低温胁迫信号通路中的关键组分。我们在拟南芥中表达的钙离子探针水母发光蛋白（AQ aequorin）,以此来检测低温引起的胞质钙离子浓度的实时变化。我们通过实验,发现低温诱导的钙信号十分迅速,低温诱导的钙信号在数秒内就达到高峰,考虑到处理时长对钙信号收集的影响,为后续大规模筛选打下基础,我们将收集钙信号的时长从10s-5min不断筛选,初步定为1分钟;我们又从0℃到20℃之间不断缩小温度范围,发现野生型在10℃冷胁迫下钙信号强度适中,能够区分出潜在的突变体。所以我们初步将筛选低温钙信号缺陷突变体的条件定为:室温条件下施加10℃低温刺激,我们使用10℃的低温条件,收集钙信号1min共筛选了81600个单株幼苗。考虑到蛋白功能冗余,多样化,所以我们在确定低温表型后又对候选突变体进行特异性检测,选取只对低温特异性缺陷的候选突变体,而对高渗,双氧水,盐离子响应正常。最终得到28个低温表型稳定,特异性明显的候选突变体,自交四代,发现其钙信号表型稳定遗传。从中选取钙信号缺陷明显,特异性又极好的突变体m17,构建作图群体,建立了1个低温引起的钙离子响应缺陷型突变体的图位克隆群体,共720个单株。利用二代测序推测获得了突变体突变基因所在的连锁染色体,图位克隆（map-based cloning）技术利用CAPs/d CAPs（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences）设计引物,对二代测序所检测到的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）突变位点,进行进一步的精细定位,初步将候选基因定在3号染色体上的5-8M物理距离范围之内。接下来的研究有望从候选突变体中得到候选基因。前人研究证实,植物能够通过短期信号的感知,长期信号通路的构建,应对胁迫。所以我们又通过短期和长期的生理表型来筛选候选突变体。短期生理实验显示,突变体m1和m17在低温条件下生长分别表现出根短,叶片黄化以及叶柄伸长等生理表型。长期生理实验显示,候选突变体莲座叶数目较野生型少,并且早花。以上说明我们筛选的突变体低温胁迫某些信号通路中出现问题,导致植物不能完全的感受外界低温信号,仍旧表先出正常条件下的生长模式。此项课题有望为研究低温刺激胁迫信号通路,钙通道机制开辟新的途径;并为基因工程抗低温作物提供潜在的分子遗传学目标。本课题截至目前部分完成了候选突变体的遗传学验证,候选突变体自然繁殖4代后,其钙信号低温相关表型始终如初,说明钙信号缺陷具有可遗传性。另一方面,我们又对两个候选突变体进行短期和长期的生理表型实验探讨,发现此突变体在低温下,根短,早花等生理表型。本文重点描述了在低温胁迫诱导下利用先进的钙成像技术筛选相关突变体的研究过程,以及通过图位克隆以期获得和低温信号通路相关的基因,同时对目标突变体的相关生理表型进行了初步探讨。