嗜冷酶能够在低温条件下保持高催化活性,究竟是什么样的分子机制能够保证它们在低温条件下原子热运动降低的同时又具有较高的催化效率?嗜冷酶的这种特殊性质也是当今酶学和蛋白质工程领域的研究热点。本文利用高温分子动力学（molecular dynamics;MD）模拟以及 PT-WTE（parallel tempering in well-tempered ensemble）分子动力学模拟,对嗜冷丝氨酸蛋白酶VPR及其同源常温丝氨酸蛋白酶PRK的稳定性、构象柔性、以及自由能图谱进行了较为深入的比较研究,以此来阐述嗜冷丝氨酸蛋白酶的低温适应机理。主要研究内容为:1.嗜冷和常温丝氨酸蛋白酶的高温分子动力学模拟比较研究。在该部分研究中,我们在获得常温丝氨酸蛋白酶PRK和嗜冷丝氨酸蛋白酶VPR晶体结构的基础上,对二者进行了高温（373 bK、473 1K和573 K）以及作为对照的常温（300 K）MD模拟。在得到模拟轨迹的基础上,比较分析了 PRK和VPR在几何属性、构象柔性、二级结构、以及解折叠路径和速率等方面的差异。结果显示:（1）当温度高于300 K时候,VPR比PRK表现出更大的结构波动、更不稳定的二级结构和更高的全局构象柔性;（2）尽管二者具有相似的解折叠路径,但是低温酶发起解折叠的温度（373 K）要低于常温酶（473 K）,且在同样的高温条件下,低温酶具有比常温酶更快的解折叠速率;（3）在三个高温条件下,VPRLkPRK显示出更大的回旋半径、更少的分子内氢键和原子间近距离接触数量、更多的蛋白质-溶剂氢键数量,同时,低温酶较常温酶暴露了更多的极性表面积,包埋了更少的非极性面积。综合上述结果,我们推测,嗜冷酶VPR的低稳定性（或高构象柔性）很可能源自其较少的分子内非共价内相互作用（焓效果）和更多的分子间（蛋白质-溶剂）相互作用,而常温酶PRK的高稳定性归因于其具有更多的分子内非共价相互作用和更紧密的疏水包装。此外,对于高温MD模拟轨迹,通过评估结构等同位置差异氨基酸结构环境的动力学行为,详细分析了造成两个蛋白酶局部构象柔性差异的结构因素。结果表明,二硫键、Ca2+结合位点、盐桥在两个蛋白酶结构上的分布差异以及某些氨基酸改变所造成的焓力和熵效果的变化是导致二者局部构象柔性差异的关键因素。通过该部分研究,我们明确了嗜冷酶VPR和常温酶PRK在热稳定性和构象柔性上的差异并找到了造成这些差异的结构或理化因子。2.嗜冷和常温丝氨酸蛋白酶的PT-WTE分子动力学模拟比较研究。在该部分研究中,我们以常温丝氨酸蛋白酶PRK和嗜冷丝氨酸蛋白酶VPR为研究对象,通过本质动力学分析手段研究两种酶的结构动态属性和动力学行为特点,并以此为基础选择本征向量PC1和PC2作为反应坐标来构建和比较常温酶和嗜冷酶的自由能图谱。结果显示:（1）本质动力学分析结果表明VPR比PRK具有更显著的大尺度协同运动,同时,这些大尺度协同构象变化主要发生在N-、C-末端、环区以及底物结合区域。其中,VPR上底物结合区域更显著的大尺度协同运动可能会通过增加底物结合亲和性的方式来提高催化效率;（2）自由能图谱结果表明,嗜冷酶VPR较常温酶PRK具有更高的最小全局自由能水平,更宽和更粗糙的自由能图谱。这一结果说明了 VPR较PRK具有更低的热稳定性,更大的构象熵和更丰富的构象多样性。由以上结果推测,VPR的更高构象柔性和更丰富构象状态在增进底物结合的同时还有利于催化过程中酶构象向反应中间态的转换,因而提高了 VPR在低温条件下的催化效率。综上所述,与常温丝氨酸蛋白酶PRK相比,嗜冷丝氨酸蛋白酶VPR具有更低的稳定性、更高的构象柔性以及更浅、更宽和更粗糙的自由能图谱。一方面,嗜冷酶的高柔性有利于酶构象状态的转换,这会产生更多的构象状态,从而有利于酶与底物的结合;另一方面,高构象柔性还有利于催化过程中酶构象向反应中间态的转换,从而使得嗜冷酶在低温条件下也能保持较高的催化活性。我们的研究结果揭示了嗜冷丝氨酸蛋白酶的稳定性-柔性-活性关系,有助于深入理解嗜冷酶的温度适应机理,也为相关实验提供理论基础和指导,同时对认识生命与环境相互作用以及促进极端环境微生物资源在生物技术产业中的应用具有重要意义。