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研究背景：
慢性肾脏病(Chronickidneydisease,CKD)是一组进行性发展的慢性疾病群，最终会进展为终末期肾脏病，而肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病进展到终末期肾脏病的病理基础和共同通路，其病理特征表现为大量的炎性细胞浸润、肌成纤维细胞激活和细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的过度堆积。肾间质纤维化(Renalinterstitialfibrosis,RIF)发生及发展的确切机制尚不完全明确，成纤维细胞与肾固有细胞及周围微环境之间相互作用的动态过程可能是其中的关键环节。Yes相关蛋白(Yes-associatedprotein,Yap)和具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TranscriptionalcoactivatorwithPDZ-bindingmotif,Taz)是Hippo通路的核心组成部分，它们在器官发展、稳态和再生方面具有多种生物功能。最近的研究发现，在动物和人体组织纤维化过程中存在异常激活的Yap/Taz信号。近年来，Yap/Taz激活状态下促增殖、抗凋亡的作用特点在多种肾脏疾病中成为研究的热点。
研究目的：
1、探讨Yap在单侧输尿管梗阻(Unilateralureteralobstruction,UUO)小鼠模型导致的肾间质纤维化发生、发展和ECM重塑中的作用；
2、探讨抑制（肌）成纤维细胞中Yap/Taz信号能否改善肾脏内ECM沉积，为延缓肾脏纤维化的治疗提供新靶点；
3、探讨阻断（肌）成纤维细胞中Yap/Taz信号是否可逆转肾脏纤维化。
研究方法：
1、SPF级8-12周龄的野生型小鼠随机分成4组，每组5只：假手术3天组、假手术7天组、UUO3天组和UUO7天组；造模成功后分别于术后3天、7天收集肾脏组织，通过PAS染色和Trichrome染色观察肾脏组织病理变化，通过免疫蛋白印迹试验检测Yap、细胞外基质蛋白纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn)和I型胶原(Collagen1,Col1)、肌成纤维细胞标记蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-Smoothmuscleactin,SMA-α)的表达，通过免疫荧光双染色检测SMA-α分别与Fn、血小板衍生因子受体α(Platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha,PDGFRα)及Yap分别与SMA-α、PDGFRα、CD45的双染情况。
2、SPF级8-12周龄的野生型小鼠随机分成4组，每组5只：假手术组、假手术+Verteporfin（维替泊芬）组、UUO组和UUO+Verteporfin组；建立UUO模型后按100mg/kg浓度腹腔注射Yap抑制剂Verteporfin或等体积DMSO,7天后收集肾脏组织，通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色、免疫蛋白印迹试验及TUNEL试验检测Yap抑制剂Verteporfin对UUO肾脏组织的病理改变、细胞外基质蛋白沉积、肌成纤维细胞标记蛋白表达与细胞凋亡的影响。
3、构建小鼠谱系示踪模型Gli1-Cre/Rosa26R-LacZ转基因小鼠，通过X-gal染色验证UUO导致Gli1+肌成纤维细胞在肾间质增殖；构建Yapf/f/Tazf/f/Gli1-CreER+/-基因型小鼠，按80mg/kg浓度腹腔注射他莫昔芬诱导（肌）成纤维细胞上Yap/Taz基因敲除(Yap/TazKO);SPF级8-12周龄的基因型小鼠与野生型小鼠随机分成4组，每组5只：野生型假手术组、野生型UUO组、基因敲除假手术组及基因敲除UUO组；造模7天后收集肾脏组织和分离原代肾脏成纤维细胞，检测Yap的表达以验证基因敲除效果，通过病理染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色及免疫蛋白印迹试验检测Yap/TazKO后对肾脏纤维化形成、细胞外基质蛋白沉积、肌成纤维细胞标记蛋白表达、细胞增殖及转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)表达的影响；
4、将SPF级8-12周龄的野生型小鼠和Yapf/f/Tazf/f/Gli1-CreER+/-基因型小鼠分为野生型RUUO组和基因敲除RUUO组，每组5只；采用无创显微血管夹夹闭单侧输尿管3天后解除夹闭的方法建立单侧输尿管梗阻再通(Release-unilateralureteralobstruction,RUUO)模型，按80mg/kg浓度腹腔注射他莫昔芬诱导小鼠肾脏内（肌）成纤维细胞上Yap/Taz基因敲除(Yap/TazKO)，于解除输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织，通过病理染色、免疫组织化学染色及免疫蛋白印迹试验检测RUUO模型下Yap/TazKO对肾脏纤维化形成、细胞外基质蛋白及肌成纤维细胞标记蛋白表达的影响。
研究结果：
1、Yap在单侧输尿管梗阻小鼠模型肾脏中的表达
肾脏病理显示UUO7天后肾脏出现间质纤维化；免疫蛋白印迹检测结果显示在UUO肾组织内Yap蛋白表达显著增高，术后第7天最明显，且大部分Yap转入细胞核中表达，其下游靶蛋白结缔组织生长因子(Connectivetissuegrowthfactor,CTGF)表达上调，细胞外基质蛋白Fn和Col1、肌成纤维细胞标记蛋白SMA-α表达增加，与假手术组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；免疫荧光双染色显示：梗阻肾肾间质内有大量SMA-α阳性的肌成纤维细胞浸润，且大部分SMA-α阳性细胞与Fn或PDGFRα阳性细胞共染，约80%间质浸润的细胞为同时表达Yap和SMA-α或Yap和PDGFRα的细胞。
2、Verteporfin抑制Yap活化后对UUO模型肾间质纤维化的影响
腹腔注射Verteporfin后，UUO小鼠肾间质胶原沉积减少，纤维化程度减轻，特异性阻断Yap信号显著抑制Fn、Col1及SMA-α、PDGFRα在梗阻肾肾间质内表达，与非抑制剂UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；免疫荧光染色发现经Verteporfin处理后UUO组织肾小管上皮细胞内E-cadherin表达上调，UUO导致的E-cadherin从基膜侧到侧膜端的易位部分逆转，而Verteporfin对血管内皮细胞上VE-cadherin的表达强度及分布、凋亡细胞的数量则无明显变化。
3、特异性（肌）成纤维细胞Yap/Taz基因敲除后对UUO模型肾间质纤维化的影响
（1）小鼠谱系示踪模型Gli1-Cre/Rosa26R-LacZ转基因小鼠肾组织X-gal染色显示：UUO肾间质中有大量Gli1+细胞浸润，提示单侧输尿管梗阻诱导肾间质肌成纤维细胞中Gli1激活及表达。
（2）配对杂交的Yapf/f/Tazf/f/Gli-CreER+/-小鼠经基因型鉴定结果显示为携带雌激素受体CreER的Gli1+细胞特异性Yapf/f/Tazf/f小鼠。
（3）通过雌激素他莫昔芬体内诱导后，免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹试验证实UUO组织内Gli1+（肌）成纤维细胞Yap基因被成功敲除；Yap/TazKO小鼠梗阻肾肾组织中CTGF、Fn、Col1及SMA-α表达下降，肾间质中肌成纤维细胞浸润和胶原沉积明显减少，与野生型UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）;Yap/TazKO不引起肾组织内细胞的凋亡，但细胞核增殖抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)阳性细胞数量明显减少，与野生型UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；野生型小鼠UUO肾间质中转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的表达明显增多，Yap/TazKO后其表达有所减轻。
4、特异性（肌）成纤维细胞Yap/Taz基因敲除对单侧输尿管梗阻再通（RUUO）模型肾间质纤维化的影响
RUUO模型中Yap/TazKO小鼠肾间质病理改变、纤维化、胶原沉积明显减轻，与野生型RUUO组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；解除单侧输尿管梗阻后，Yap/TazKO小鼠肾间质Fn、Col1及SMA-α、PDGFRα随着Yap的缺失而表达减少，与野生型RUUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
Yap/Taz信号激活促进了肾脏Gli1+肌成纤维细胞的增殖、活化，参与肾脏纤维化的发生、发展。
慢性肾脏病(Chronickidneydisease,CKD)是一组进行性发展的慢性疾病群，最终会进展为终末期肾脏病，而肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病进展到终末期肾脏病的病理基础和共同通路，其病理特征表现为大量的炎性细胞浸润、肌成纤维细胞激活和细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的过度堆积。肾间质纤维化(Renalinterstitialfibrosis,RIF)发生及发展的确切机制尚不完全明确，成纤维细胞与肾固有细胞及周围微环境之间相互作用的动态过程可能是其中的关键环节。Yes相关蛋白(Yes-associatedprotein,Yap)和具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TranscriptionalcoactivatorwithPDZ-bindingmotif,Taz)是Hippo通路的核心组成部分，它们在器官发展、稳态和再生方面具有多种生物功能。最近的研究发现，在动物和人体组织纤维化过程中存在异常激活的Yap/Taz信号。近年来，Yap/Taz激活状态下促增殖、抗凋亡的作用特点在多种肾脏疾病中成为研究的热点。
研究目的：
1、探讨Yap在单侧输尿管梗阻(Unilateralureteralobstruction,UUO)小鼠模型导致的肾间质纤维化发生、发展和ECM重塑中的作用；
2、探讨抑制（肌）成纤维细胞中Yap/Taz信号能否改善肾脏内ECM沉积，为延缓肾脏纤维化的治疗提供新靶点；
3、探讨阻断（肌）成纤维细胞中Yap/Taz信号是否可逆转肾脏纤维化。
研究方法：
1、SPF级8-12周龄的野生型小鼠随机分成4组，每组5只：假手术3天组、假手术7天组、UUO3天组和UUO7天组；造模成功后分别于术后3天、7天收集肾脏组织，通过PAS染色和Trichrome染色观察肾脏组织病理变化，通过免疫蛋白印迹试验检测Yap、细胞外基质蛋白纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn)和I型胶原(Collagen1,Col1)、肌成纤维细胞标记蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-Smoothmuscleactin,SMA-α)的表达，通过免疫荧光双染色检测SMA-α分别与Fn、血小板衍生因子受体α(Platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha,PDGFRα)及Yap分别与SMA-α、PDGFRα、CD45的双染情况。
2、SPF级8-12周龄的野生型小鼠随机分成4组，每组5只：假手术组、假手术+Verteporfin（维替泊芬）组、UUO组和UUO+Verteporfin组；建立UUO模型后按100mg/kg浓度腹腔注射Yap抑制剂Verteporfin或等体积DMSO,7天后收集肾脏组织，通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色、免疫蛋白印迹试验及TUNEL试验检测Yap抑制剂Verteporfin对UUO肾脏组织的病理改变、细胞外基质蛋白沉积、肌成纤维细胞标记蛋白表达与细胞凋亡的影响。
3、构建小鼠谱系示踪模型Gli1-Cre/Rosa26R-LacZ转基因小鼠，通过X-gal染色验证UUO导致Gli1+肌成纤维细胞在肾间质增殖；构建Yapf/f/Tazf/f/Gli1-CreER+/-基因型小鼠，按80mg/kg浓度腹腔注射他莫昔芬诱导（肌）成纤维细胞上Yap/Taz基因敲除(Yap/TazKO);SPF级8-12周龄的基因型小鼠与野生型小鼠随机分成4组，每组5只：野生型假手术组、野生型UUO组、基因敲除假手术组及基因敲除UUO组；造模7天后收集肾脏组织和分离原代肾脏成纤维细胞，检测Yap的表达以验证基因敲除效果，通过病理染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色及免疫蛋白印迹试验检测Yap/TazKO后对肾脏纤维化形成、细胞外基质蛋白沉积、肌成纤维细胞标记蛋白表达、细胞增殖及转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)表达的影响；
4、将SPF级8-12周龄的野生型小鼠和Yapf/f/Tazf/f/Gli1-CreER+/-基因型小鼠分为野生型RUUO组和基因敲除RUUO组，每组5只；采用无创显微血管夹夹闭单侧输尿管3天后解除夹闭的方法建立单侧输尿管梗阻再通(Release-unilateralureteralobstruction,RUUO)模型，按80mg/kg浓度腹腔注射他莫昔芬诱导小鼠肾脏内（肌）成纤维细胞上Yap/Taz基因敲除(Yap/TazKO)，于解除输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织，通过病理染色、免疫组织化学染色及免疫蛋白印迹试验检测RUUO模型下Yap/TazKO对肾脏纤维化形成、细胞外基质蛋白及肌成纤维细胞标记蛋白表达的影响。
研究结果：
1、Yap在单侧输尿管梗阻小鼠模型肾脏中的表达
肾脏病理显示UUO7天后肾脏出现间质纤维化；免疫蛋白印迹检测结果显示在UUO肾组织内Yap蛋白表达显著增高，术后第7天最明显，且大部分Yap转入细胞核中表达，其下游靶蛋白结缔组织生长因子(Connectivetissuegrowthfactor,CTGF)表达上调，细胞外基质蛋白Fn和Col1、肌成纤维细胞标记蛋白SMA-α表达增加，与假手术组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；免疫荧光双染色显示：梗阻肾肾间质内有大量SMA-α阳性的肌成纤维细胞浸润，且大部分SMA-α阳性细胞与Fn或PDGFRα阳性细胞共染，约80%间质浸润的细胞为同时表达Yap和SMA-α或Yap和PDGFRα的细胞。
2、Verteporfin抑制Yap活化后对UUO模型肾间质纤维化的影响
腹腔注射Verteporfin后，UUO小鼠肾间质胶原沉积减少，纤维化程度减轻，特异性阻断Yap信号显著抑制Fn、Col1及SMA-α、PDGFRα在梗阻肾肾间质内表达，与非抑制剂UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；免疫荧光染色发现经Verteporfin处理后UUO组织肾小管上皮细胞内E-cadherin表达上调，UUO导致的E-cadherin从基膜侧到侧膜端的易位部分逆转，而Verteporfin对血管内皮细胞上VE-cadherin的表达强度及分布、凋亡细胞的数量则无明显变化。
3、特异性（肌）成纤维细胞Yap/Taz基因敲除后对UUO模型肾间质纤维化的影响
（1）小鼠谱系示踪模型Gli1-Cre/Rosa26R-LacZ转基因小鼠肾组织X-gal染色显示：UUO肾间质中有大量Gli1+细胞浸润，提示单侧输尿管梗阻诱导肾间质肌成纤维细胞中Gli1激活及表达。
（2）配对杂交的Yapf/f/Tazf/f/Gli-CreER+/-小鼠经基因型鉴定结果显示为携带雌激素受体CreER的Gli1+细胞特异性Yapf/f/Tazf/f小鼠。
（3）通过雌激素他莫昔芬体内诱导后，免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹试验证实UUO组织内Gli1+（肌）成纤维细胞Yap基因被成功敲除；Yap/TazKO小鼠梗阻肾肾组织中CTGF、Fn、Col1及SMA-α表达下降，肾间质中肌成纤维细胞浸润和胶原沉积明显减少，与野生型UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）;Yap/TazKO不引起肾组织内细胞的凋亡，但细胞核增殖抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)阳性细胞数量明显减少，与野生型UUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；野生型小鼠UUO肾间质中转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的表达明显增多，Yap/TazKO后其表达有所减轻。
4、特异性（肌）成纤维细胞Yap/Taz基因敲除对单侧输尿管梗阻再通（RUUO）模型肾间质纤维化的影响
RUUO模型中Yap/TazKO小鼠肾间质病理改变、纤维化、胶原沉积明显减轻，与野生型RUUO组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；解除单侧输尿管梗阻后，Yap/TazKO小鼠肾间质Fn、Col1及SMA-α、PDGFRα随着Yap的缺失而表达减少，与野生型RUUO组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
Yap/Taz信号激活促进了肾脏Gli1+肌成纤维细胞的增殖、活化，参与肾脏纤维化的发生、发展。