临床治疗心肌炎以控制全身急性炎症反应为主,寻找既能降低心肌炎性损伤,又能减缓心肌重塑的治疗方法依然是目前面临的难点和重点。巴多昔芬（Bazedoxifene,BAZ）是第三代雌激素受体调节剂,经FDA批准上市用于临床预防和治疗绝经期女性骨质疏松症,长期使用安全性和耐受性良好。本研究旨在观察巴多昔芬对自身免疫性心肌炎的治疗效果,探讨巴多昔芬影响Th17细胞免疫应答的作用机制。本研究包括以下三个部分:第一部分巴多昔芬对小鼠自身免疫性心肌炎疗效观察目的:探讨BAZ对自身免疫性心肌炎小鼠心脏炎性损伤和心脏功能的影响。方法:将雄性近交系Balb/c小鼠随机分为三组:对照组（control组）,实验性自身免疫性心肌炎造模组（EAM组）和巴多昔芬干预组（BAZ组）。在实验第0天和第7天,向EAM组和BAZ组小鼠皮下淋巴结处注射α肌球蛋白重链来源的多肽（MyHC-α614-629）,建立实验性自身免疫性心肌炎模型。第7天到21天,BAZ组小鼠每天给予BAZ（5mg/Kg/day,po.）进行干预。在实验终点21天时,小鼠超声心动图观察各组小鼠心脏形态和功能变化;测量小鼠血压比较全身反应。观察各组小鼠心脏大体观表现,记录小鼠体重变化,计算小鼠心脏重量/体重比值、心脏重量/胫骨长度比值。心脏组织切片HE染色观察小鼠心肌组织内炎性细胞浸润;Masson染色观察心脏纤维化程度。CD45免疫组化染色比较心肌组织淋巴细胞数量,IL-6免疫组化染色比较小鼠心肌组织内炎症因子表达水平。心肌组织TUNEL和外周血cTnI ELISA检测评估心肌炎性损伤程度。结果:与对照组小鼠相比,EAM组小鼠体重降低,心脏重量/体重和心脏重量/胫骨长度比值升高。心脏收缩功能降低,血压没有明显变化。HE和Masson染色结果显示心肌组织炎性评分提高,心肌纤维化明显。免疫组化结果显示EAM小鼠CD45阳性淋巴细胞浸润增多,IL-6表达升高。TUNEL和外周血cTnI显示EAM小鼠心肌细胞坏死。与EAM组相比,BAZ组小鼠体重降低不明显,心脏重量/体重和心脏重量/胫骨长度比值降低,心脏收缩功能恢复,EF%和FS%升高。HE和Masson染色结果显示心肌组织炎性评分降低,心肌纤维化程度减轻。免疫组化结果显示EAM小鼠CD45阳性淋巴细胞浸润减少。TUNEL和外周血cTnI结果显示EAM小鼠心肌细胞坏死减少,心肌损伤得到缓解。结论:BAZ可降低自身免疫性心肌炎小鼠心肌组织中淋巴细胞浸润程度,减轻心肌炎症损伤,改善心肌肥厚和纤维化,缓解心功能不全。第二部分 巴多昔芬对小鼠自身免疫性心肌炎疗效机制探讨目的:探讨BAZ对自身免疫性心肌炎小鼠免疫应答中Th17细胞分化和功能的影响。方法:小鼠造模和药物干预方案同前。在实验进程21天时,分离心脏淋巴细胞并计数,流式细胞术检测CD4+Th17细胞和Treg细胞的比例;Western blot检测各组小鼠心脏淋巴细胞P-STAT3、STAT3、RORyt、FOXP3表达水平;RT-PCR检测各组小鼠心脏淋巴细胞RORγt、FOXP3、IL-6和IL-17转录水平。取免疫初期14天和免疫高峰期21天小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞术比较各组小鼠Th17细胞和Treg细胞比例;Western blot 检测各组小鼠脾脏 CD4+T 细胞 P-STAT3、STAT3、RORγt、FOXP3表达水平;RT-PCR检测各组小鼠脾脏CD4+T细胞RORγt,Th17细胞相关炎性细胞因子IL-17A、IL-21和IL-22的转录水平;Treg细胞FOXP3及相关细胞因子IL-35、TGF-β和IL-10的转录水平。最后检测各组小鼠脾脏内抗原提呈细胞（DCs）比例,ELISA检测其释放的炎症因子IL-23和IL-6水平。结果:自身免疫性心肌炎导致小鼠心脏组织内淋巴细胞总数升高,其中CD4+Th17细胞比例提高,CD4+Treg细胞比例降低;心脏淋巴细胞中P-STAT3和RORγt转录及表达水平升高;FOXP3转录及表达水平降低;IL-6和IL-17A转录水平升高。与EAM组小鼠相比,BAZ组Th17细胞比例降低,Treg细胞比例变化不明显;P-STAT3和RORyt转录及表达水平降低;FOXP3转录水平升高;IL-6和IL-17A转录水平降低。在第14天和第21天时,EAM小鼠脾脏增大;脾脏CD4+Th17细胞比例升高,P-STAT3和RORyt转录及表达水平升高;Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-21和IL-22的转录水平升高。而在第14天CD4+Treg 比例降低,FOXP3转录和表达水平下降;Treg细胞相关细胞因子IL-35、TGF-β和IL-10的转录被抑制。在第21天Treg细胞比例没有明显变化;FOXP3转录和表达水平、Treg细胞相关细胞因子IL-35、TGF-β和IL-10的转录均在不同程度上有所升高。BAZ干预后,在14天和21天小鼠脾脏内Th17细胞比例均降低;P-STAT3和RORγt转录及表达水平下调;Th17细胞相关炎性细胞因子IL-17A、IL-21和IL-22的转录水平也降低。而BAZ对Treg细胞的作用并不一致,在第14天BAZ提高Treg细胞比例,上调FOXP3转录和表达水平、提高Treg细胞相关细胞因子IL-35、TGF-β和IL-10的转录水平。在第21天BAZ下调FOXP3转录和表达水平、降低Treg细胞相关细胞因子IL-35、TGF-β和IL-10的转录水平。另外,BAZ降低自身免疫性心肌炎小鼠脾脏升高的CD11c阳性DC,降低其分泌的IL-23和IL-6水平。结论:BAZ抑制STAT3/RORγt信号通路改变EAM小鼠心肌组织和脾脏中的Th17细胞分化和功能。BAZ对Treg细胞的影响在不同阶段表现不同,在免疫初期上调Treg细胞分化和功能,在免疫高峰期则对Treg细胞免疫应答没有明显影响。另外,BAZ可下调树突状细胞分泌炎症因子IL-23、IL-6的能力。第三部分 巴多昔芬调控Th17细胞作用机制的体外实验研究目的:体外Th17细胞极化实验进一步研究BAZ对Th17细胞分化和功能的影响。方法:健康Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞经过磁珠分选,提纯出na（?）ve CD4+T细胞,在体外多细胞因子刺激条件下进行Th17细胞和Treg细胞极化。BAZ对其干预后,流式细胞术检测Th17细胞分化、CFSE增殖比例和Treg细胞分化比例。透射电镜和免疫荧光定位实验比较Th17诱导组和BAZ组中自噬体的形成,自噬标志性蛋白与IL-17共表达的变化趋势。同时Western blot检测P-STAT3、RORγt和自噬标志性蛋白（LC3,P62和Beclin-1）表达水平的变化,并设立Stattic（STAT3靶向抑制剂）干预组进行阳性对照。为了讨论BAZ对Th17的影响是否与雌激素信号通路有关,分选雌性和雄性小鼠的脾脏na（?）ve CD4+T细胞进行Th17体外极化,并给予巴多昔芬（5μM）干预。设立雌二醇和Stattic对照组,同样干预体外极化的Th17细胞,比较不同处理对Th17细胞分化的影响。结果:流式结果显示,与对照组Th17细胞相比,随着BAZ干预浓度的升高,体外刺激诱导的Th17细胞分化比例逐渐降低,Th17细胞增殖率逐渐下降。但是在BAZ作用下,Treg细胞分化比例没有明显升高或降低。Western blot结果显示BAZ干预后,STAT3磷酸化和RORγt表达水平均有所降低,Th17细胞比例降低。同时,BAZ干预后自噬改变的标志性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高,P62表达降低,Beclin-1表达降低。5μM Stattic干预体外诱导的Th17细胞,并与BAZ组进行比较,Western blot结果显示Stattic同样能够抑制RORyt表达,同时增加LC3Ⅱ/Ⅰ表达,降低P62和Beclin-1表达水平,增强细胞自噬反应。透射电镜显示BAZ处理后的na（?）ve CD4+T细胞形成双层膜自噬小体增多。免疫荧光结果显示BAZ处理后,在同一个细胞中IL-17和磷酸化STAT3蛋白同时降低;IL-17和LC3表达变化相反,而IL-17和Beclin-1、P62表达水平同时降低。最后流式结果显示BAZ对雌性和雄性小鼠的Th17细胞干预作用没有明显差异。与对照组相比,雌激素并不能提高体外极化下Th17的细胞比例,而Stattic能够明显抑制Th17细胞的分化。结论:BAZ抑制STAT3激活降低体外诱导的Th17细胞分化,增强细胞中自噬反应;其对Th17细胞分化和功能的抑制作用不依赖雌激素信号通路。BAZ对Treg细胞没有明显抑制或促进作用。