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苝醌类化合物(PQ)是一类天然存在的光敏化合物,作为光敏剂可用于抗癌、抗病毒和治疗皮肤病等方面,具有重要的药用价值。但由于苝醌类化合物的来源有限、产量不足,无法满足大规模的临床治疗和开发应用,液体发酵生产次生代谢产物具有周期短、生产效率高等优势,而受到人们的高度重视。本研究以实验室前期筛选到的一株蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14为对象,开展液态发酵中碳源对内生真菌Shiraia sp.Slf14产PQ的影响,发现果糖有利于内生真菌Shiraia sp.Slf14的PQ合成,然后通过转录组技术分析了果糖促进其PQ合成的机制。本研究不仅能为进一步探究PQ合成途径提供参考,而且可为PQ大规模生产奠定基础。(1)开展不同碳源对Shiraia sp.Slf14合成PQ的影响,发现果糖为最佳碳源,在60g/L果糖最适浓度下,Shiraia sp.Slf14的PQ产量达到1753.64 mg/L,为葡萄糖作为碳源时的1.73倍。(2)开展了Shiraia sp.Slf14分别以果糖和葡萄糖为碳源时的转录组分析。经Illumina HiSeq~TMM 4000平台测序,总计得到9627310966 nt数据。组装转录组本14596个,平均长度1525.37 bp,N50为2597 bp。转录本注释到NR、Swiss-Prot、Pfam、String、GO和KEGG数据库,数目分别是10441,5624,6777,3465,7151和3913。根据KEGG数据库中的注释结果,3913个Unigenes注释到了327个KEGG通路中。根据差异基因表达分析,总计有9183个差异基因,其中有212个上调基因,主要参与转运系统、能量代谢和碳代谢途径。(3)基于转录组分析进一步探讨了果糖促进Shiraia sp.Slf14合成PQ的分子机制,发现参与糖酵解、磷酸戊糖途径和编码柠檬酸合成酶、ATP柠檬酸裂解酶和乙酰辅酶A羧化酶的基因表达水平都大幅上调,这有利于前体化合物乙酰辅酶A和丙二酸酰辅酶A的合成。同时,参与糖异生作用、乙醛酸循环途径和脂肪酸合成的基因表达均显著下调,这必然导致较多的乙酰辅酶A流向PQ合成途径。进一步开展了实时荧光定量PCR及相关途径酶活性分析,结果与转录组分析一致。此外,我们发现以果糖为碳源时,前期预测竹红菌甲素(HA)生物合成簇明显上调。这些结果不仅能够帮助我们了解果糖促进PQ合成的机制,而且为揭示内生真菌Shiraia sp.Slf14的PQ生物合成途径奠定基础。(4)探讨了Shiraia sp.Slf 14利用果糖基生物质菊粉发酵生产PQ的可行性,并对其菊粉酶进行了克隆分析。发现菊粉适合于Shiraia sp.Slf 14的PQ合成。同时成功克隆了内生真菌Shiraia sp.Slf 14菊粉酶基因(Inu),该基因开放阅读框长度为1774 bp,编码572个氨基酸。将Inu基因与pET-22b(+)载体连接,转化于E.coil DH5α,进而在E.coil BL21中异源表达;得到无活性的菊粉酶(包涵体),经包涵体复性后得到具有活性的菊粉酶,酶学性质表明该菊粉酶为外切型菊粉酶,同时还进行了生物信息学分析,从而了解了真菌竹黄菌能利用菊粉生产苝醌类化合物的原因。本论文已初步研究了果糖促进内生真菌Shiraia sp.Slf14合成苝醌类化合物的作用机制,并通过研究菊粉酶为切入点以期为后续内生真菌Shiraia sp.Slf14利用廉价菊粉高产苝醌类化合物提供方向,这也将为苝醌类化合物的代谢调控奠定基础。