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创伤性损伤或肿瘤切除可能会导致大量软组织丢失，这需要使用自体软组织皮瓣进行手术重建。然而，这种方法通常由于缺乏高质量的自体皮瓣和供体部位发病率较高而受到限制。使用自体组织皮瓣的另一种策略是使用同种异体组织皮瓣。不幸的是，同种异体移植的存活率取决于使用慢性非特异性和新型特异性免疫抑制药物，其中许多药物具有致肿瘤、机会性感染和/或终末器官毒性的风险。
理论上来说，不需要使用免疫抑制剂的工程复合组织瓣可以为自体瓣和同种异体组织瓣提供理想的、临床上可行的替代方案。皮肤/脂肪组织皮瓣是常规重建显微外科手术的主要力量。因此，皮肤/脂肪组织皮瓣工程在重建外科领域具有巨大的应用前景。然而，皮瓣为不均质组织，常规去细胞的过程存在复杂耗时长、制备条件苛刻等缺点，难以实现制作流程标准化。
因此，本研究的目的是建立一个简便可靠的去细胞方法来制备皮瓣。使用磁力搅拌器辅助震荡去细胞法处理来自大鼠的腹部皮瓣。该方法的可靠性通过去细胞效率的数据，以及制备完成后的去细胞皮瓣的表征结果得到了初步的验证。随后，通过将去细胞皮瓣在皮下包埋来测试其生物相容性，并在移植后取外周血进行简单的排斥程度检测。本研究的结果可能会为设计和制造用于修复软组织缺损的3D带血管的皮瓣组织构建平台的开发提供基础数据。
目的：
本项的目的是开发一种更简便的去细胞皮瓣制备方案，对应用该方案获得的去细胞皮瓣进行去细胞支架相关系列鉴定，之后将去细胞皮瓣和未处理皮瓣分别皮下包埋于成年SD大鼠背部检测其生物相容性，致力于为获得一种方法简便、材料安全的去细胞材料的制备方案提供新思路。
方法：
1去细胞皮瓣的制备
1.1制备流程：取健康成年SD大鼠20只，取下腹壁处皮瓣，行腹壁下动脉留置针插管灌注肝素钠生理盐水，室温下使用磁力搅拌器进行辅助震荡，震荡液依次为1%Triton X-100溶液、0.08%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液及去离子水。
1.2鉴定过程：对收获的去细胞皮瓣行DNA定量分析、总蛋白定量分析、SDS残留量检测、核染色、扫描电镜等去细胞支架鉴定。
2去细胞皮瓣的生物相容性鉴定
2.1动物模型制作：将去细胞皮瓣和未处理皮瓣分别皮下包埋于成年SD大鼠背部（每组20只，每个时间点每组随机取5只），每只大鼠沿脊柱包埋四块材料，每块去细胞皮瓣材料大小约1cm2。术后常规饲养。
2.2对于去细胞材料的再生情况：于术后1周和2周取移植物进行HE染色，统计小血管数量。同时通过QPCR检测移植物中VEGF、IGF等促进血管生长的细胞因子含量。
2.3对于术后全身免疫情况监控：于术后1周和2周采用流式细胞术检测外周血调节性T淋巴细胞比例检测。
2.4对于去细胞材料的局部免疫状态：于术后第1,3,7,14天的移植物进行巨噬细胞、单核细胞的免疫组化染色和western bolt定量分析。同时通过QPCR检测移植物中IL-1、IL-6、IL-10、bFGF、TNF-α、TGF-β等炎症相关细胞因子含量。
3数据统计
本实验的所有数据都代表了至少三次独立实验的结果。统计结果分析采用GrapHPad Prism7软件。P＜0.05，代表有统计学意义，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
结果：
1去细胞皮瓣的鉴定
1.1三种震荡方案制备得到的去细胞皮瓣的DNA含量较对照组均下降超过95%，但DAPI染色显示1.5h+12h组具有更好的结果。
1.2对1.5h+12h组的皮瓣进行扫描电镜及HE染色，观察到去细胞组保留大量细胞外基质，血管造影显示血管分支完整、清晰。扫描电镜显示较连续的蛋白纤维。
2去细胞皮瓣的生物相容性鉴定
2.1对于术后全身免疫情况监控：实验组大鼠外周血调节性T淋巴细胞比例在术后1周和2周均高于对照组，。提示实验组大鼠整体的免疫排斥反应是不强烈的。
2.2从术后第1周和第2周移植组织切片的HE染色显示随着时间的推移，移植物的体积减少，细胞密度增加。在第1周移植物中即可观察到显着的血管结构和聚集的红细胞。血管数目的统计结果也表明，去细胞组能获得更活跃的血管再生现象。
2.3对于单核细胞，免疫组化组化染色比较分析结果显示，实验组的单核细胞（CD11b）标记表达一直低于对照组。但Western blot相对定量结果则是：对照组组从术后1天达巅峰后一直下降，实验组组则是逐渐上升至7天后开始下降。将数据均一化分析后发现，实验组最高点仍然低于对照组，说明实验组组不管是从反应的趋势还是强度都可能与对照组不同。
2.4对于巨噬细胞，通过免疫组化染色比较分析，伴随着时间的进展，实验组的巨噬细胞（CD68标记）表达一直低于对照组，通过进一步的Western blot实验表明，移植入体的材料不论去细胞与否，均会导致巨噬细胞在组织中富集，但实验组的表达一直低于对照组。但通过进一步的CD163（M2型巨噬细胞）的表达分析，去细胞组的表达高于对照组，提示去细胞皮瓣能促使巨噬细胞从炎症表型向抗炎表型分化。
2.5对于移植物中相关的细胞因子，通过QPCR检测结果显示：对于血管再生相关细胞因子，IGF和VEGF在实验组中的表达均高于对照组；而对于炎症反应相关因子，实验组IL-1,IL-6这类炎性指标的表达均低于对照组实验组IL-1,IL-6这类炎性指标的表达均低于对照组；IL-10为抗炎促生长的指标在手术后1-14天内均高于对照组；TNF-α的表达在术后1天高于对照2倍，其后时间的表达均低于对照；TGF-β1的表达的总体趋势是在术后降低，随后升高；而FOXP3的表达一直高于对照。
结论：
在本研究中，确定了最优的去细胞震荡洗涤方案，即肝素钠生理盐水0.5h，1%Triton1.5h，0.08%SDS12h，去离子水3h，全程耗时少于17h。应用该方案制备获得的去细胞皮瓣去细胞组DNA含量较对照组下降超过95%，DAPI染色未见明显细胞核，扫描电镜及HE染色观察到去细胞组保留大量细胞外基质，血管造影显示去细胞组血管分支完整、清晰。动物实验显示去细胞组为低排斥且具有更好的生物相容性，具体的表现包括更活跃的血管再生情况、更高比例的外周血调节性T淋巴细胞、更低水平表达的巨噬细胞及单核细胞聚集、更高水平表达的VEGF和IGF以及更低表达的IL-1、IL-6等炎症因子。本方法可成功制备完整的去细胞皮瓣，可为自体皮瓣和同种异体组织皮瓣提供理想的，临床上可行的替代方案，同时也提供了确切证明去细胞材料安全性的证据。
理论上来说，不需要使用免疫抑制剂的工程复合组织瓣可以为自体瓣和同种异体组织瓣提供理想的、临床上可行的替代方案。皮肤/脂肪组织皮瓣是常规重建显微外科手术的主要力量。因此，皮肤/脂肪组织皮瓣工程在重建外科领域具有巨大的应用前景。然而，皮瓣为不均质组织，常规去细胞的过程存在复杂耗时长、制备条件苛刻等缺点，难以实现制作流程标准化。
因此，本研究的目的是建立一个简便可靠的去细胞方法来制备皮瓣。使用磁力搅拌器辅助震荡去细胞法处理来自大鼠的腹部皮瓣。该方法的可靠性通过去细胞效率的数据，以及制备完成后的去细胞皮瓣的表征结果得到了初步的验证。随后，通过将去细胞皮瓣在皮下包埋来测试其生物相容性，并在移植后取外周血进行简单的排斥程度检测。本研究的结果可能会为设计和制造用于修复软组织缺损的3D带血管的皮瓣组织构建平台的开发提供基础数据。
目的：
本项的目的是开发一种更简便的去细胞皮瓣制备方案，对应用该方案获得的去细胞皮瓣进行去细胞支架相关系列鉴定，之后将去细胞皮瓣和未处理皮瓣分别皮下包埋于成年SD大鼠背部检测其生物相容性，致力于为获得一种方法简便、材料安全的去细胞材料的制备方案提供新思路。
方法：
1去细胞皮瓣的制备
1.1制备流程：取健康成年SD大鼠20只，取下腹壁处皮瓣，行腹壁下动脉留置针插管灌注肝素钠生理盐水，室温下使用磁力搅拌器进行辅助震荡，震荡液依次为1%Triton X-100溶液、0.08%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液及去离子水。
1.2鉴定过程：对收获的去细胞皮瓣行DNA定量分析、总蛋白定量分析、SDS残留量检测、核染色、扫描电镜等去细胞支架鉴定。
2去细胞皮瓣的生物相容性鉴定
2.1动物模型制作：将去细胞皮瓣和未处理皮瓣分别皮下包埋于成年SD大鼠背部（每组20只，每个时间点每组随机取5只），每只大鼠沿脊柱包埋四块材料，每块去细胞皮瓣材料大小约1cm2。术后常规饲养。
2.2对于去细胞材料的再生情况：于术后1周和2周取移植物进行HE染色，统计小血管数量。同时通过QPCR检测移植物中VEGF、IGF等促进血管生长的细胞因子含量。
2.3对于术后全身免疫情况监控：于术后1周和2周采用流式细胞术检测外周血调节性T淋巴细胞比例检测。
2.4对于去细胞材料的局部免疫状态：于术后第1,3,7,14天的移植物进行巨噬细胞、单核细胞的免疫组化染色和western bolt定量分析。同时通过QPCR检测移植物中IL-1、IL-6、IL-10、bFGF、TNF-α、TGF-β等炎症相关细胞因子含量。
3数据统计
本实验的所有数据都代表了至少三次独立实验的结果。统计结果分析采用GrapHPad Prism7软件。P＜0.05，代表有统计学意义，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
结果：
1去细胞皮瓣的鉴定
1.1三种震荡方案制备得到的去细胞皮瓣的DNA含量较对照组均下降超过95%，但DAPI染色显示1.5h+12h组具有更好的结果。
1.2对1.5h+12h组的皮瓣进行扫描电镜及HE染色，观察到去细胞组保留大量细胞外基质，血管造影显示血管分支完整、清晰。扫描电镜显示较连续的蛋白纤维。
2去细胞皮瓣的生物相容性鉴定
2.1对于术后全身免疫情况监控：实验组大鼠外周血调节性T淋巴细胞比例在术后1周和2周均高于对照组，。提示实验组大鼠整体的免疫排斥反应是不强烈的。
2.2从术后第1周和第2周移植组织切片的HE染色显示随着时间的推移，移植物的体积减少，细胞密度增加。在第1周移植物中即可观察到显着的血管结构和聚集的红细胞。血管数目的统计结果也表明，去细胞组能获得更活跃的血管再生现象。
2.3对于单核细胞，免疫组化组化染色比较分析结果显示，实验组的单核细胞（CD11b）标记表达一直低于对照组。但Western blot相对定量结果则是：对照组组从术后1天达巅峰后一直下降，实验组组则是逐渐上升至7天后开始下降。将数据均一化分析后发现，实验组最高点仍然低于对照组，说明实验组组不管是从反应的趋势还是强度都可能与对照组不同。
2.4对于巨噬细胞，通过免疫组化染色比较分析，伴随着时间的进展，实验组的巨噬细胞（CD68标记）表达一直低于对照组，通过进一步的Western blot实验表明，移植入体的材料不论去细胞与否，均会导致巨噬细胞在组织中富集，但实验组的表达一直低于对照组。但通过进一步的CD163（M2型巨噬细胞）的表达分析，去细胞组的表达高于对照组，提示去细胞皮瓣能促使巨噬细胞从炎症表型向抗炎表型分化。
2.5对于移植物中相关的细胞因子，通过QPCR检测结果显示：对于血管再生相关细胞因子，IGF和VEGF在实验组中的表达均高于对照组；而对于炎症反应相关因子，实验组IL-1,IL-6这类炎性指标的表达均低于对照组实验组IL-1,IL-6这类炎性指标的表达均低于对照组；IL-10为抗炎促生长的指标在手术后1-14天内均高于对照组；TNF-α的表达在术后1天高于对照2倍，其后时间的表达均低于对照；TGF-β1的表达的总体趋势是在术后降低，随后升高；而FOXP3的表达一直高于对照。
结论：
在本研究中，确定了最优的去细胞震荡洗涤方案，即肝素钠生理盐水0.5h，1%Triton1.5h，0.08%SDS12h，去离子水3h，全程耗时少于17h。应用该方案制备获得的去细胞皮瓣去细胞组DNA含量较对照组下降超过95%，DAPI染色未见明显细胞核，扫描电镜及HE染色观察到去细胞组保留大量细胞外基质，血管造影显示去细胞组血管分支完整、清晰。动物实验显示去细胞组为低排斥且具有更好的生物相容性，具体的表现包括更活跃的血管再生情况、更高比例的外周血调节性T淋巴细胞、更低水平表达的巨噬细胞及单核细胞聚集、更高水平表达的VEGF和IGF以及更低表达的IL-1、IL-6等炎症因子。本方法可成功制备完整的去细胞皮瓣，可为自体皮瓣和同种异体组织皮瓣提供理想的，临床上可行的替代方案，同时也提供了确切证明去细胞材料安全性的证据。