大豆E3泛素连接酶基因GmAIRP1的克隆与功能鉴定

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近年来,干旱、盐碱以及低温等非生物胁迫已经成为威胁全球农作物生长的一个重要因素,因此提高农作物对非生物胁迫的耐受能力,有利于提高农作物质量与产量、有效利用耕地以及保障粮食安全。一些研究中发现,泛素/26S蛋白酶体途径作为一种蛋白质翻译后修饰途径,不但对高等植物的生长发育极其重要,而且对植物抵御非生物胁迫也有重要作用。因此,发掘与该途径有关的新基因,可以充实作物耐胁迫基因工程的基因资源,从而为分子育种提供参考。  本研究以具有丰富抗逆基因的大豆栽培品种合丰45为材料,利用同源克隆技术,从大豆中克隆了一个与拟南芥AtAIRP1基因同源的RING-finger型E3泛素连接酶基因,通过生物信息学的方法分析了该基因的功能;利用半定量RT-PCR技术分析在不同非生物胁迫处理下该基因表达的差异;将该基因导入烟草中,对转基因植株进行抗逆性分析,确定该基因与非生物胁迫抗性的关系。主要研究结果如下:  1. GmAIRP1基因的克隆与序列分析  根据拟南芥AtAIRP1基因氨基酸序列在大豆基因组数据库(www. Phytozome. com/soybean)中进行同源序列检索,将检索出的同源序列通过 RT-PCR的方法进行克隆,并将该基因命名为GmAIRP1。该基因编码了一个213个氨基酸的RING-H2型E3泛素连接酶,是一个新的RING-finger型E3泛素连接酶基因。  2. GmAIRP1基因在逆境胁迫和激素诱导下的表达模式分析  把大豆栽培品种合丰45幼苗分别用干旱(20% PEG6000)、盐(200 mmol/L NaCl)和ABA(100μmol/L)进行胁迫处理,取处理时间0、0.5、1、3、6、12、24h大豆叶片,提取总RNA,反转录成cDNA第一链,通过半定量RT-PCR分析GmAIRP1基因的表达模式。结果表明三种处理条件均能诱导该基因的表达,并在短时间内表达量显著提高。  3. GmAIRP1基因对烟草的遗传转化  构建了植物表达载体pBI121-GmAIRP1,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得了表达GmAIRP1基因的阳性植株。用200 mmol/L NaCl和200 mmol/L甘露醇处理转基因烟草T0代。结果发现,转基因植株比野生型植株生长量高,生长状态好。  4.转基因烟草的抗逆性鉴定  用200 mmol/L NaCl和20%PEG6000处理转基因烟草T0代,对两组植株进行了抗逆表型分析与POD、CAT、MDA、游离脯氨酸等生理指标的测定。结果表明,转基因烟草的生长状态明显好于野生烟草,且转基因植株清除自由基的能力和调节渗透压的能力整体上高于野生植株,揭示 GmAIRP1可能参与了植物的抗逆调控过程,结合半定量RT-PCR结果,推测该基因的过表达可提高转基因植株抗逆性。
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