鹅星状病毒（Goose astrovirus,GAst V）是引起新型雏鹅痛风病的病原,新型雏鹅痛风病是一种以内脏型痛风为主要特征的动物传染病。GAst V主要通过消化道、呼吸道进行水平传播,也发生垂直传播。自2016年起,国内多个地区鹅养殖场报道了雏鹅痛风病的爆发,发病鹅出现关节肿大、生长迟缓等临床症状,剖解发现鹅内脏及关节腔附着有大量尿酸盐沉淀。根据临床调查统计,鹅痛风主要感染20日龄以下雏鹅,感染鹅群发病率达80%,死亡率最高达73.2%,具有明显的传染性,一旦在鹅群中出现便可快速传播,抗生素治疗无明显效果。目前对GAst V引起的雏鹅内脏型痛风临床上并没有能有效对症治疗的药物,预防上也没有商品化的疫苗,因此对此病的防控能力有限。为了有效防控该病,需要进一步开展鹅星状病毒的生物学特性研究,为防治鹅星状病毒病提供理论依据。本试验通过流行病学方法调查各鹅养殖场鹅痛风病发病情况,并收集全国各地共18个鹅养殖场的鹅痛风病病样,选择出1一份具有典型患痛风病症状的病鹅样本,采用宏基因组测序技术进行测序,对宏基因组检测结果进行验证;接种鹅胚、病原序列分析及动物回归试验对鹅星状病毒进行鉴定;之后使用RT-PCR对GAst V基因进行片段扩增,克隆测序后经生物学软件对GAst V全基因组序列进行组装、拼接及分析;分别建立GAst V的Taq Man探针荧光定量PCR检测方法和SYBR Green I染料荧光定量PCR检测方法,检验并比较两者的特异性、敏感性及稳定性。研究结果如下:1.鹅痛风病致病原的探究本试验从全国5个省（直辖市）共18个鹅养殖场采集到138份具有鹅痛风症状的临床病料,患病鹅年龄在8-37日龄,不同养殖场的死亡率在8.9%-73.2%之间,其主要临床症状表现为腹泻、厌食、抑郁、脱水、消瘦和瘫痪,剖检可见主要病变为大量尿酸盐沉积,可见于肾脏、心包、法氏囊、肌肉和腿部关节等,流行病资料显示该病具有明显的传染性,且患病鹅利用抗生素治疗无效,初步分析该病应与病毒性病原的感染有关。据此本试验首先选取1份具有典型患痛风病症状的病鹅样本,取其肾脏、脾脏和法氏囊等组织样本,混合后分别提取其总RNA和DNA,送至华大基因公司采用宏基因组测序技术测序,测序结果结合临床分析显示该病可能与鹅星状病毒的感染有关;进而参考NCBI已发布鹅星状病毒设计特异性引物,利用RT-PCR方法对宏基因组的测序结果进行验证,结果显示发病鹅组织样本中鹅星状病毒为阳性,与宏基因组测序结果一致。随后本试验扩大样本量,将临床收集到的其余样本均进行鹅星状病毒的检测,同时也对临床常见的其他8种病原进行了检测,包括AIV、NDV、DRV、DHAV、Du CV、DTMUV、REV和MDRV。检测结果显示,127份临床样本鹅星状病毒均为阳性,且其余8种病原均为阴性。综上可初步得出结论,鹅痛风病与鹅星状病毒的感染密切相关。2.鹅星状病毒的分离鉴定为了进一步验证鹅星状病毒是鹅痛风病的致病原,本试验对山东潍坊某鹅养殖场发病鹅样本进行病毒的分离与鉴定:病料匀浆液经尿囊腔接种11日龄鹅胚,结果显示鹅胚在24-96 h内死亡,主要病变为死亡胚体全身出血、肾脏肿大、斑驳和尿囊膜内有白色尿酸盐;用鹅星状病毒特异性引物经RT-PCR扩增得到明亮条带,送测序比对分析,结果显示为鹅星状病毒阳性,随后将其命名为鹅星状病毒SD株。HA试验结果显示SD株对鸡血红细胞不具有凝集性。动物回归试验结果显示,接种SD株尿囊液的试验组鹅临床与剖解症状与鹅星状病毒致病痛风鹅一致,对照组无明显症状,观察期结束后两组存活鹅的平均体重和平均尿酸含量均差异极显著（P＜0.01）;切片观察结果显示,对照组鹅肝组织、肾组织、脾组织及肠组织均正常,试验组出现肝组织窦状隙扩张、肝细胞坏死,肾组织肾小球萎缩、肾小管管腔中充满蓝染尿酸盐颗粒,脾组织出血、实质细胞大面积坏死,肠毛细血管扩张充血等现象。综上说明本试验分离鉴定得到的病毒株SD株为鹅星状病毒。3.SD株全基因组序列扩增及遗传进化分析为了加深对鹅星状病毒的了解,本试验对分离鉴定得到的鹅星状病毒SD株进行全基因组测序及分析:参考与SD株部分序列相似度高的已发布的鹅星状病毒全基因组序列用Primer 5.0软件设计分段扩增引物共6对,测序结果经NCBI在线比对显示6个片段均为鹅星状病毒;利用DNAstar Lasergene v7.1软件Seq Man程序组装拼接得到SD株全基因组序列,结果显示SD株全基因组长度为7 128 nt,含5’-UTR与3’-UTR及ORF1a、ORF1b、ORF2三个开放阅读框,NCBI登录号OM937013;将SD株与Gen Bank上发表的25株星状病毒科病毒进行全基因组序列比对,运用Mega软件NJ程序对SD株全基因序列和ORF2的氨基酸序列与比对毒株构建了系统进化树,结果显示SD株与参考株中鹅星状病毒参考株同源性为61.2%-98.9%,禽属星状病毒的同源性为52.9%-98.9%,哺乳动物星状病毒的同源性为46.0%-50.7%;进化树分析结果显示SD株在进化树上与HN03株、AHAU3株和AHAU5株在同一分支上,FLX株单独为一分支。综上说明SD株具有鹅星状病毒典型结构,属于星状病毒科禽星状病毒属,在进化关系上与鸭星状病毒和火鸡星状病毒相近。4.荧光定量PCR检测方法的建立为了方便临床上对鹅星状病毒的检测,本试验基于鹅星状病毒ORF1b基因保守序列建立荧光定量PCR检测方法:首先根据GAst V的ORF1b基因保守序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,分别建立Taq Man和SYBR Green I荧光定量PCR方法,并对其进行特异性、敏感性、重复性测定和临床样品检验。结果表明:两种方法均能特异性检测GAst V,Ct值在质粒标准品浓度2.5×10~8 copies/μL-2.5×10~2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数均为0.999;探针法和染料法的最低检测限分别为2.5×10~1 copies/μL和2.5×10~2copies/μL;两种方法重复性实验组内与组间变异系数均小于2.50%。对2021年收集的113份临床疑似样本进行检测,探针法和染料法的阳性检出率分别为69.91%和60.18%,检出率均显著高于普通RT-PCR检测方法（P＜0.01）。表明两种荧光定量PCR方法均可应用于鹅源星状病毒的临床检测和分子流行病学调查。