鸡卵清蛋白上游启动子转录因子2（chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2,COUP-TFⅡ,又名NR2F2）,是核受体家族的重要成员之一,属于类固醇激素受体超家族。NR2F2作为转录因子在组织中广泛表达,可直接激活或抑制靶基因的转录活性,调控细胞内多条信号通路,参与细胞分化、神经发生、器官形成等过程,在骨骼、肌肉、脂肪形成与代谢平衡过程中起调节作用。目前,围绕NR2F2基因的研究主要集中在其对人类癌症等疾病、小鼠肌肉与脂肪等组织的作用机理,针对猪的NR2F2基因研究还未见相关报道。本试验旨在探究NR2F2基因及其通过调控下游基因对细胞增殖、凋亡、迁移的影响机制,为进一步研究NR2F2基因通过调控TGF-β信号通路影响猪生长发育的分子机制提供理论基础。本试验通过克隆测序获得猪NR2F2基因的CDS序列;通过生物信息学分析预测该基因的蛋白质结构、功能、定位等;利用qRT-PCR技术检测猪NR2F2基因的时空性表达特征;构建过表达NR2F2基因慢病毒载体,包装病毒液后,感染PK15细胞,通过qRT-PCR、WB检测增殖相关的基因表达变化,通过CCK-8、EdU检测细胞的增殖情况,通过流式细胞仪检测对细胞周期、凋亡的影响,通过划痕试验检测对细胞迁移的影响,通过Co-IP验证NR2F2与Smad4蛋白结合情况,检测对TGF-β信号通路下游靶基因的影响以及挽救试验探究NR2F2基因调控细胞增殖的作用机制。试验结果如下:1.成功获得了马身猪NR2F2基因CDS区,全长846 bp,编码281个氨基酸,该基因及其所编码的蛋白在不同物种中高度保守。NR2F2基因在马身猪各组织中均表达,在肾脏和脾脏中表达量最高,在肺中中度表达,在其他组织中表达量较低。NR2F2基因在马身猪背最长肌中随日龄表达逐渐升高,在大白猪中表达逐渐降低。2.利用三种转染方法将空载体和过表达NR2F2基因载体转染PK15细胞,其中慢病毒转染法转染效率高,细胞存活率高,且能够稳定的遗传下去。3.过表达NR2F2基因后,显著增加了NR2F2基因的表达量,显著增加了PCNA、Ki67基因的表达,促进细胞从G1期向S期转变,抑制细胞凋亡、促进细胞迁移。4.Co-IP证明NR2F2能与Smad4相互结合,且过表达NR2F2基因后,TGF-β信号通路中Smad4基因表达增加,下游靶基因细胞周期相关因子Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D1表达显著增加;敲除NR2F2基因后,TGF-β信号通路中Smad4基因表达降低,下游靶基因细胞周期相关因子Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D1表达显著降低;过表达NR2F2基因后,进一步干扰Smad4基因的表达,细胞周期相关因子Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D1表达降低,检测细胞增殖基因的表达,PCNA与Ki67基因表达量降低,能有效缓解过表达NR2F2基因后对细胞的影响,表明NR2F2基因是通过调控Smad4基因进而影响细胞的增殖。综上所述,本研究成功克隆了猪NR2F2基因CDS区序列,初步探讨了NR2F2基因通过调控Smad4基因表达影响TGF-β信号通路传导进而影响细胞增殖的机制,对TGF-β信号通路调控细胞增殖网络进行了补充,为进一步研究NR2F2基因通过TGF-β信号通路影响猪生长发育的分子机制提供理论基础,对进一步研究马身猪这一种质资源有重要的意义。