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海洋生态系统是地球上最大的生态系统,微生物资源丰富。生活在海洋中的微生物,由于其生存环境的特殊性,决定了所产的酶在性质、功能上与陆生生物有很多不同。酯酶与脂肪酶作为酯类水解酶,在工业上具有广泛的应用前景。本课题旨在从海洋微生物中筛选克隆有特性的酯酶与脂肪酶基因,构建稳定遗传的基因工程菌株,并研究其性质。本文从海鳗肠道内容物和海鲍肠道内容物中筛选得到能高效降解三丁酸甘油酯的海洋细菌S9与S30。通过形态学观察及16S rDNA鉴定,初步确定菌株S30为伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.),菌株S9为不动杆菌属(Acinetobacter sp.),并命名为Burkholderia sp. S30 与 Acinetobacter sp. S9。利用分子生物学技术从Burkholderia sp. S30中克隆得到脂肪酶基因Lip。Lip全长1092 bp编码364个氨基酸,其中前1-41个氨基酸预测为信号肽,序列已提交GenBanK登录(KJ631420)。构建真核表达载体pPICZa-C-Lip,并在Pichia pastorisX33中实现了异源分泌表达。甲醇诱导培养重组菌X33-pPICZa-C-Lip,获得重组脂肪酶,以pNPP为底物对重组菌发酵上清液进行活性测定,酶活力为118.8 U/L,SDS-PAGE电泳结果显示该脂肪酶分子量约为36.6 kDa。测定重组蛋白的基本酶学性质,结果表明该重组脂肪酶最适作用温度和pH分别为55℃和8.5,在60℃以下及pH 8.0-10.0时较稳定。PCR扩增获得Acinetobacter sp. S9的酯酶基因Est。Est编码区全长909 bp,编码303个氨基酸,其中前1-19个氨基酸预测为信号肽,序列已提交GenBanK登录(KJ019019)。构建真核表达载体pPICZa-C-Est,并在Pichia pastoris X33中实现了异源分泌表达。甲醇诱导培养工程菌株X33-pPICZa-C-Est,并对发酵上清液进行活性测定,以pNPC2为底物测定重组酯酶的酶活力为1683.1 U/L,比出发菌株酶活提高了2.6倍。经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等步骤,对重组酯酶进行分离纯化,得到了比活为27.28 U/mg的酯酶,SDS-PAGE电泳结果显示该重组酯酶的分子量约为33.7 kDa。对酯酶进行酶学性质研究,结果表明该酯酶最适作用pH和温度分别为8.0和40℃,在pH 8.0-10.0及温度低于70℃时稳定性较好,酶动力学研究表明该酶Vmax为13.587μmol/mL·min, Km为0.804μmol/mL本文从海洋微生物筛选获得的酯酶与脂肪酶基因异源表达后的蛋白同陆生来源的该类酶相比,反应温度较低,且pH耐受性较好,表明其具有潜在应用价值。