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缺血性脑卒中是指脑供血动脉狭窄或栓塞所致脑组织缺血性坏死的疾病,具有较高的发病率、死亡率、致畸率和复发率。恢复缺血脑组织血流再灌注在挽救缺血半暗带的同时会加重脑部损伤,即脑缺血-再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CI/RI）,如脑水肿、神经元坏死、自由基损伤、神经炎症等。减轻脑缺血-再灌注损伤有助于促进卒中后神经功能的恢复,改善患者预后,是缺血性卒中治疗的重要策略之一。拟人参皂苷F11（Pseudoginsenoside-F11,PF11）是西洋参中一种特征性奥克梯隆型人参皂苷,具有抗炎、抗氧化和神经系统保护作用等活性。现有研究报道,静脉注射PF11能通过抑制细胞内钙超载减少脑缺血-再灌注模型大鼠的脑梗死面积、减轻神经元损伤。PF11口服给药能通过影响脑组织中小胶质细胞/巨噬细胞极化过程,降低脑缺血-再灌注模型大鼠的神经炎症。PF11口服能通过激活BDNF/Trk B通路改善脑缺血-再灌注模型小鼠的神经功能障碍。本课题组前期研究发现,PF11滴丸具有较好的抗心肌缺血活性。大鼠体内开展的药代动力学研究表明,滴丸提高了PF11的溶出速度和生物利用度,口服PF11滴丸3小时后在大鼠脑组织中有较高分布。目前,尚未报道PF11滴丸在脑缺血-再灌注损伤方面的作用。PF11具有多种药理活性,能从多靶点、多途径对疾病进行干扰。从蛋白和代谢层面共同分析PF11对脑缺血-再灌注损伤的保护作用,有助于挖掘更多潜在治疗靶点和生物标志物,促进缺血性脑卒中的诊断、治疗和预后。本文在已有研究的基础上,拟考察口服PF11滴丸对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用,采用非标定量蛋白组学技术和非靶向代谢组学技术进一步探究其作用机制,分析缺血性脑卒中发作后大鼠体内相关蛋白质和代谢物的变化规律,旨在探寻PF11治疗缺血性脑卒中的潜在作用靶点和生物标志物。主要开展了以下研究内容:一、PF11滴丸抗脑缺血-再灌注损伤作用研究预防性灌胃给予PF11滴丸（12.5、25、50 mg/kg）14天后,采用短暂性大脑中动脉栓塞法（Transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO）建立经典大鼠脑缺血-再灌注模型,治疗性给药3天,收集脑组织和血液样本,评价PF11滴丸的药理作用。结果表明,PF11滴丸以剂量依赖性地降低神经功能缺损评分（Modified neurologic severity scores,m NSS）,缩小脑梗死面积,降低脑含水量,减少伊文思蓝和神经元特异性烯醇酶（Neuron specific enolase,NSE）泄漏量,下调IL-1β、IL-6和TNF-α水平,增强SOD活性,减少MDA含量。说明PF11滴丸能改善缺血性脑卒中引起的神经功能障碍、减轻继发性损伤、保护受损血脑屏障、减轻炎症和氧化应激反应,发挥对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。二、基于非标定量蛋白组学的PF11滴丸抗脑缺血-再灌注损伤研究基于Nano Elute UHPLC-tims TOF Pro技术平台对大鼠脑组织中蛋白质组成及表达水平开展非标定量蛋白组学分析,利用Max Quant软件和Uniprot数据库进行蛋白鉴定。在Sham组、Model组及PF11组中共鉴定出319个差异表达蛋白。GO生物功能和KEGG信号通路富集分析结果显示,差异表达蛋白参与轴突鞘化、神经元细胞髓鞘化、脑部发育等生物过程,影响神经棘、树突棘、髓鞘和突触的形成和髓鞘结构性成分生成,主要涉及c AMP信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路和Tight junction等通路。蛋白-蛋白相互作用（Proteinprotein interaction,PPI）网络拓扑学分析得到了10个关键靶点,包括RHOA、CAMK2A、GRIN2B、SYN1和MBP等。进一步分子对接结果表明PF11与以上5个靶点之间的结合能均小于-7 kcal/mol,形成较稳定的结合构象。以上研究显示,PF11滴丸通过调节t MCAO模型大鼠脑组织中相关差异蛋白的表达来维持血脑屏障的稳定性、促进神经传导过程,减轻脑缺血-再灌注所致神经功能损伤。其中,RHOA、CAMK2A、GRIN2B、SYN1和MBP是PF11滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在作用靶点。三、基于非靶向代谢组学的PF11滴丸抗脑缺血-再灌注损伤研究基于UPLC-Q/TOF-MS技术对大鼠脑组织和血清中的代谢物开展非靶向代谢组学分析。借助Mass Lynx V4.1软件完成质谱数据前处理,利用HMDB数据库和相关标准品进行差异代谢物的鉴定。在Sham组、Model组及PF11组中共鉴定出18个潜在生物标志物,包含苯丙氨酸、酪氨酸、鞘氨醇-1-磷酸和Lyso PE（16:0/0:0）等。利用Metabo Analyst 5.0在线平台完成了潜在生物标志物的代谢途径分析,共得到14条代谢通路,苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢,神经鞘脂质代谢和色氨酸代谢为主要代谢途径。提示PF11滴丸通过调节t MCAO模型大鼠体内氨基酸和脂质代谢紊乱来减轻脑缺血-再灌注损伤。四、PF11滴丸抗脑缺血-再灌注损伤的蛋白组学-代谢组学整合分析采用典型相关分析（Canonical correlation analysis,CCA）和Pearson相关系数开展蛋白组学-代谢组学整合分析,认定Pearson相关系数＞0.6且p＜0.05时,差异表达蛋白和差异代谢物具有强相关性。分析结果显示,11种差异代谢物（包括苯丙酮酸、苯丙氨酸、酪氨酸、鞘氨醇-1-磷酸等）与25个差异表达蛋白（包括ICAM5、ACTN1、RHOA、CAMK2A、GRIN2B和MBP等）存在强相关性。蛋白组学研究中,MBP、RHOA、CAMK2A和GRIN2B是PF11滴丸抗缺血性脑卒中潜在作用靶点。整合分析中,这4个靶点与差异代谢物具有强相关性,进一步揭示以上4个靶点的重要性。提示PF11滴丸可影响相关差异蛋白的表达来调控缺血性脑卒中大鼠体内氨基酸的水平,改善脑缺血-再灌注导致的代谢紊乱,发挥对机体的保护作用。综上,本实验首次开展了PF11滴丸对脑缺血-再灌注损伤的保护作用,并首次结合蛋白组学和代谢组学技术探讨其作用机制。通过蛋白组学研究预测了PF11滴丸治疗缺血性脑卒中的5个潜在作用靶点和4条关键的信号通路;通过代谢组学研究预测了18个潜在生物标志物和4条关键的代谢途径;通过蛋白组学-代谢组学整合分析揭示了差异蛋白和差异代谢物之间的相关性,进一步表明MBP、RHOA、CAMK2A和GRIN2B是PF11滴丸治疗缺血性脑卒中潜在作用靶点,为PF11滴丸进一步开发为1类化学创新药物提供了理论基础。