研究背景脑胶质瘤是最常见的恶性肿瘤之一,占颅脑肿瘤的40%～50%。据最新资料统计,脑胶质瘤的发病率为3-10/10万,目前脑胶质瘤的治疗以显微手术切除为主,术后辅以化疗和放疗,但由于胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤呈浸润性生长,广泛深入正常脑组织,且对放化疗均不敏感,手术创伤及放化疗又对机体免疫力产生抑制和破坏,致使其复发率和死亡率普遍居高不下。因此,在杀伤肿瘤细胞的同时,尽量减少手术创伤和提高术后的免疫水平对胶质瘤的治疗有着重要的意义,也是当前脑胶质瘤治疗最具前景的战略发展方向。随着分子生物学和肿瘤免疫学的快速发展,免疫疗法已经成为继手术治疗、放疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。我们前期研究表明：经氩氦冷冻治疗后的荷C6胶质瘤的大鼠模型不仅破坏了肿瘤细胞,而且诱导病灶周围细胞凋亡,同时外周血CD3+、 CD4+、CD8+、CD14+、CD16+56+淋巴细胞数以及Thl/Th2比值均有显著升高,荷瘤动物平均生存时间显著较对照组延长(P<0.01),证实氩氦冷冻治疗除了直接杀灭肿瘤细胞,还能增强细胞免疫功能,提高抗肿瘤能力,实现了微创和免疫促进的完美结合,同时也为进一步作用机制的研究打下了夯实的基础。冷冻荷瘤动物可以有效激活机体的抗肿瘤免疫反应已经得到国内外的证实,但其机制仍然没有明确的定论。冷冻治疗产生的免疫机制主要针对于冷疗所产生的环境有利于抗原呈递细胞对此微环境中的肿瘤特异性抗原产生响应,从而进一步刺激T细胞产生细胞免疫作用杀伤残存肿瘤。冷疗是导致组织坏死的一种有效手段,细胞坏死包括了细胞膜的破损及其内部细胞质及细胞器等内容物释放。这个过程对于免疫细胞来说,是一个很强的刺激信号。同时坏死又激发了更多的细胞因子的释放,使得这些抗原递呈细胞被激活的可能性大大提高。与热疗不同的是,冷冻治疗并不会对肿瘤内部的抗原肽产生很大的破坏。这些相对完整的肿瘤特异性抗原肽随着肿瘤细胞的坏死被释放到周围环境中,很容易被抗原呈递细胞摄取并呈递给T细胞从而产生免疫效应。有学者对乳腺癌的小鼠进行冷冻治疗发现,小鼠治疗后产生了抵抗二次接种肿瘤的免疫力,同时在局部近肿瘤淋巴结中发现了T细胞响应。也有观点认为,冷冻导致的坏死可以引起肿瘤抗原的释放,这些抗原可能进入机体循环系统而到达外周免疫器官,被B淋巴细胞摄取后,激活产生针对这些抗原的抗体。正常机体免疫系统可以识别和杀伤突变的细胞,从而清除肿瘤细胞或抑制其生长,但是肿瘤细胞可通过其高突变的特性,逃避免疫监视并且建立免疫抑制微环境,抵抗和抑制机体抗肿瘤免疫反应。在肿瘤组织中,除了大量肿瘤细胞,还有成纤维细胞、免疫细胞、髓源抑制性细胞等以及包含多种功能的细胞因子在内的细胞外基质,这构成了支持肿瘤生长的微环境。随着肿瘤的发生与发展,肿瘤微环境尤其是肿瘤免疫微环境向抑制性免疫微环境转变,包括抗肿瘤的免疫效应细胞的缺失及无功能化,免疫抑制细胞的增多,免疫效应分子的减少与免疫抑制分子的增加等,帮助了肿瘤进一步逃脱自身免疫监视,加剧了肿瘤进展。树突状细胞是一种专职的抗原提呈细胞,不仅可以激活外源性病原免疫反应,而且,在诱导抗肿瘤免疫反应中同样发挥着关键作用。但是,肿瘤微环境中一些抑制性细胞因子影响树突状细胞的功能,调节性T细胞(Treg)也可通过自身表达的免疫抑制性分子影响树突细胞的功能,这些树突状细胞又能进一步诱导Treg的分化和增殖,这些耐受性树突状细胞低表达协调刺激信号和XHC2类分子,并且通过工D0等诱导T细胞失能。然而,氩氦冷冻肿瘤后对于肿瘤免疫抑制坏境的改变仍不得而知,需要进一步研究。CTLA4是表达在活化T细胞和Treg细胞上的抑制性共刺激分子受体,anti-CTLA4抗体(ipilimumab)在2011年被美国FDA批准用于晚期有转移的黑色素瘤患者的治疗。CTLA4阻滞可以抑制T细胞中的CTLA4信号传导,逆转CTLA4对于效应T细胞的抑制,同时也可阻断CTLA4对于Treg的激活。有研究表明,在小鼠模型中,全身注射anti-CTLA4可以促进肿瘤内侵润效应T细胞的增加,减少Treg细胞的数量,增加Teff/Treg比例。Anti-CTLA4抗体联合GM-CSF疫苗在小鼠脑胶质瘤中也取得了显著的效果。虽然有些研究证实,anti-CTLA4抗体联合氩氦冷冻对于治疗黑色素瘤具有良好的疗效,但是否也适用于小鼠脑胶质瘤,还需进一步的研究,并且相对全身系统性用药的严重副作用,局部肿瘤应用单抗是否更具优势,也是一个亟待解决的问题。基于以上研究背景,我们首先利用氩氦冷冻皮下胶质瘤小鼠模型,观察冻融前后肿瘤引流淋巴结中免疫抑制微环境的变化,尤其是肿瘤相关免疫抑制性树突状细胞功能上的影响,进一步确证氩氦冷冻对于肿瘤免疫功能的恢复。其次,我们建立脑内原位胶质瘤小鼠模型,原位注射anti-CTLA4抗体及氩氦冷冻肿瘤裂解物,观察各组抗肿瘤疗效,研究抗肿瘤机制,探索一种脑胶质瘤治疗的新方法,为进一步的临床应用提供试验证据。第一章氩氦冷冻肿瘤对免疫抑制性树突状细胞功能的影响目的：研究氩氦冷冻肿瘤后对于肿瘤引流淋巴结中的免疫抑制性树突状细胞功能的影响。方法：通过建立皮下GL261胶质瘤小鼠模型,利用氩氦冷冻治疗或普通手术切除治疗,将小鼠分为空白对照组、肿瘤对照组、氩氦冷冻肿瘤组及手术切除肿瘤组。在给予处理2周后,分离肿瘤引流淋巴结,流式检测肿瘤引流淋巴结中的树突状细胞的数量、表型及白介素10(IL-10)的表达。利用CFSE流式检测肿瘤引流淋巴结中的树突状细胞刺激T细胞增殖能力。利用T细胞细胞毒试验检测T细胞对肿瘤细胞杀伤能力。对处理小鼠再次接种GL261胶质瘤细胞,检测其二次抗肿瘤免疫能力,测量二次接种肿瘤体积,绘制二次肿瘤生长曲线。记录二次肿瘤小鼠生存期,绘制生存期曲线。免疫荧光检测二次肿瘤中侵润树突状细胞的表达。再各组小鼠处理后,清除调节性T细胞(Treg),记录各组小鼠生存期,绘制生存期曲线。结果：成功构建皮下GL261胶质瘤小鼠模型并实施治疗分组。成功分离各组肿瘤引流淋巴结,流式检测肿瘤引流淋巴结中树突状细胞：CD80和CD86的表达在四组之间有显著差异,有统计学差异(F=79.625,P<0.001)(F=98.452,P<0.001),其中,肿瘤对照组比空白对照组显著降低(CD80,P<0.001:CD86,P<0.001),氩氦冷冻肿瘤组较手术切除肿瘤组显著升高(CD80,P<0.001:CD86,P<0.001)。空白对照组与肿瘤对照组、手术切除肿瘤组之间MHC Ⅱ表达无显著差异(P=0.702,P=0.491),但氩氦冷冻肿瘤组的树突状细胞MHC Ⅱ显著高于其他三组,具有统计学意义(P=0.012,P=0.022,P=0.004)。各组间引流淋巴结中树突状细胞数量差异有统计学意义(F=19.904,P<0.001),其中氩氦冷冻肿瘤组的引流淋巴结中树突状细胞的绝对数量显著高于肿瘤对照组(P=0.003),而各组间的树突状细胞IL-10表达率差异有统计学意义(F=108.407,P<0.001)其中树突状细胞IL-10的表达率显著低于肿瘤对照组(P<0.001)和手术切除肿瘤组(P<0.001),而肿瘤对照组和手术切除肿瘤组显著高于空白对照组(P<0.001,P<0.001)。对比各组IL-10的分泌量,空白对照组、肿瘤对照组、氩氦冷冻肿瘤组、手术切除肿瘤组分泌IL-10量分别为：78±37.24pg/ml、766.6±115.9pg/ml、 177.7±46.7pg/ml、596.6±310.9 pg/ml。各组间IL-10分泌量差异有统计学意义(F=30.524,P<0.001),其中肿瘤对照组、手术切除肿瘤组分泌IL-10高于氩氦冷冻肿瘤组,有统计学意义(P<0.001、P=0.001),氩氦冷冻肿瘤组与空白对照组无显著统计学差异(P=0.272)。在淋巴混合培养实验中,随着DC：T细胞比例不断增加(1：3、1：1、3：1),空白对照组、氩氦冷冻肿瘤组中T细胞的增殖率上涨显著,而肿瘤对照组、手术切除肿瘤组的T细胞增殖较为缓慢。在DC：T=3：1的大比例下,氩氦冷冻肿瘤组中T细胞的增殖率显著高于肿瘤对照组(P<0.001)和手术切除肿瘤组(P=0.001),具有统计学意义。在肿瘤细胞杀伤实验中,效应T细胞与靶细胞GL261小鼠胶质瘤细胞分别以E：T为10、50、100的比例共培养4小时,利用CCK-8法检测其靶细胞杀伤能力。氩氦冷冻肿瘤组的靶细胞GL261小鼠胶质瘤细胞杀伤率均高于其他各组(E:T=10、50、100, P<0.001; E:T=10,50、100, P<0.001; E:T=10、50.100, P<0.001)。氩氦冷冻肿瘤组的二次接种肿瘤大小514.8±310.8mm3,显著小于空白对照二次接种肿瘤995.6±225.7mm3(P=0.049)及手术切除肿瘤组的二次接种肿瘤1032.7±277.4mm3(P=0.037),但生存期无显著差异(P=0.109,P=0.091)。二次肿瘤免疫荧光染色后发现,手术切除肿瘤组的二次肿瘤组织中侵润的树突状细胞较多的表达IL-10,而氩氦冷冻肿瘤组的二次肿瘤组织中侵润的树突状细胞则较少的表达IL-10。在清除Treg细胞后,空白对照组小鼠平均生存期为36.6±3.37天,肿瘤对照+清除Treg组小鼠平均生存期为35.2±4.8天,氩氦冷冻肿瘤+清除Treg组小鼠平均生存期为66.6±7.5天,手术切除肿瘤+清除Treg组小鼠平均生存期为44.6±5.4天。氩氦冷冻肿瘤+清除Treg组小鼠生存期显著优于空白对照组,有统计学差异(P=0.011)。结论：氩氦冷冻小鼠GL261胶质瘤可以改变肿瘤引流淋巴结中的树突状细胞的数量及表型,降低免疫抑制因子IL-10的表达,增强刺激T淋巴细胞的能力,提高效应T细胞对小鼠GL261胶质瘤细胞的杀伤能力。可延缓二次接种肿瘤的生长速度,减少二次肿瘤中侵润表达IL-10的树突状细胞,同时予以清除免疫调节细胞Treg,可增强抵抗二次肿瘤的能力,延长二次肿瘤生存期。第二章氩氦冷冻裂解物联合anti-CTLA4抗体原位治疗颅内胶质瘤小鼠的疗效分析目的：通过探索氩氦冷冻裂解物联合anti-CTLA4抗体原位治疗颅内胶质瘤小鼠,分析其抗肿瘤疗效,研究其抗肿瘤机制。方法：建立颅内胶质瘤小鼠模型,采用颅内原位注射氩氦冷冻裂解物及／或anti-CTLA4抗体,分为肿瘤对照组(小鼠右脑尾状核接种1x1O5/5μl GL261小鼠胶质瘤细胞,不予任何治疗。)、anti-CTLA4治疗组(小鼠右脑尾状核接种1×105/5μlGL261小鼠胶质瘤细胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗体各一次,每次10gg。)、氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组(小鼠右脑尾状核接种1xlO5/5μl GL261小鼠胶质瘤细胞后第3、6天原位注射氩氦冷冻胶质瘤裂解物各一次,每次10μg。)、联合治疗组(小鼠右脑尾状核接种1xlO5/5μl GL261小鼠胶质瘤细胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗体各一次,每次10gg；第3、6天原位注射氩氦冷冻胶质瘤裂解物各一次,每次10μg。),计算各组生存期,评估各组神经毒性反应,分离脑侵润淋巴细胞,流式检测CD4+、CD8+T淋巴细胞变化,计算CD4+、CD8+T细胞与Foxp3+Treg细胞比例,检测脑侵润淋巴细胞肿瘤细胞杀伤能力,免疫荧光证实脑侵润淋巴细胞,提取脑肿瘤组织,检测肿瘤微环境中IL-10. IL-12、IL-4及IFN-gama表达情况,给予清除CD4+、CD8+T淋巴细胞后,分析各组小鼠生存期,评价其疗效机制。结果：成功建立脑胶质瘤小鼠模型并按照各组实施治疗。治疗操作可靠,未见因治疗手术操作死亡小鼠。肿瘤对照组、anti-CTLA4治疗组、氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组、联合治疗组小鼠平均生存期为28.8±1.31天、39.9±3.8天、32.7±1.7天、51.9±3.4天,治疗组生存期均优于肿瘤对照组,(P=0.010,P=0.028, P<0.001), anti-CTLA4治疗组和氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组生存期无显著统计学差异(P=0.123),联合治疗组生存期优于anti-CTLA4治疗组及氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组(P=0.046,P=0.001)。神经系统评分中,在肿瘤接种第7天,肿瘤对照组评分平均秩次为12.05,联合治疗组评分平均秩次为8.95,Z=-1.33,P=0.181,两组差异无统计学意义。在肿瘤接种第13天,肿瘤对照组评分平均秩次为14.2,联合治疗组评分平均秩次为6.8,Z=-2.87,P=0.004,两组差异有统计学意义,肿瘤对照组评分高于联合治疗组评分。肿瘤对照组脑组织HE染色,可见脑内胶质瘤巨大,侵润正常脑组织,而联合治疗组脑组织HE染色,可见正常脑组织,未见肿瘤细胞侵润,可见淋巴细胞侵润。经免疫荧光染色后,肿瘤对照组中有较少脑CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞侵润。联合治疗组可见较多的脑侵润CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。流式细胞术检测脑侵润淋巴细胞,对于脑侵润淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞的比例,联合治疗组显著高于肿瘤对照组(P<0.001). anti-CTLA4治疗组(P=0.002)和氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组(P<0.001)；对于脑侵润淋巴细胞中CD8+T淋巴细胞的比例,联合治疗组显著高于肿瘤对照组(P<0.001), anti-CTLA4治疗组(P<0.001)和氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组；联合治疗组中的CD4+, CD8+T淋巴细胞相对数量计数分别为0.46±0.048/Million、0.71 ±0.019/Million,显著高于其他三组(所有P<0.001)。同样,肿瘤对照组与联合治疗组的脾脏淋巴细胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例无显著统计学差异(P=0.713),但脑侵润淋巴细胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例,联合治疗组显著高于肿瘤对照组(P=0.005)；肿瘤对照组与联合治疗组的脾脏淋巴细胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例无显著统计学差异(P=0.102),但脑侵润淋巴细胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例,联合治疗组高于肿瘤对照组7倍(P=0.003)。在肿瘤细胞杀伤实验中,效应细胞：靶细胞为10、20、40时,联合治疗组脑侵润淋巴细胞杀伤效率均高于脾脏淋巴细胞组(P=0.005、P<0.001、P<0.001)和肿瘤对照组(P=0.007、P<0.001、P<0.001),在联合治疗组中,脑侵润淋巴细胞对于GL261小鼠胶质瘤细胞的杀伤效率均高于B16小鼠黑色素瘤细胞(效靶比=10,P=0.002、效靶比=20,P<0.001、效靶比=40,P<0.001)和Hepal-6小鼠肝细胞癌细胞(效靶比=10,P=0.002、效靶比=20,P<0.001、效靶比=40,P<0.001)。同时,联合治疗组脑侵润淋巴细胞杀伤GL261小鼠胶质瘤细胞释放的IFN-gama剂量显著大于正常小鼠脾脏淋巴细胞(P<0.001)和肿瘤对组脑侵润淋巴细胞(P<0.001)的释放量。在荧光定量PCR检测脑肿瘤组织细胞因子实验中,联合治疗组脑肿瘤组织中IL-10的表达仅为肿瘤对照组的三分之一(P=0.02),而氩氦冷冻肿瘤裂解物治疗组中IL-10的表达为肿瘤对照组的1.6倍(P=0.036)。联合治疗组脑肿瘤组织中IL-12的表达为肿瘤对照组表达的7.17±1.51倍,有统计学差异(P<0.001)。联合治疗组脑肿瘤组织中IL-4的表达为肿瘤对照组表达的0.53±0.24倍,有统计学差异(P=0.024)。联合治疗组脑肿瘤组织中IFN-gama的表达为肿瘤对照组表达的3.76±0.25倍,有统计学差异(P<0.001)。在清除CD4+或CD8+淋巴细胞后,联合治疗小组小鼠与联合治疗+CD4-depletion小鼠生存期无显著差异(P=0.134),联合治疗+CD8-depletion小鼠生存期显著少于联合治疗组小鼠,有统计学差异(P<0.001)。结论：肿瘤原位注射anti-CTLA4抗体联合肿瘤冻融裂解物可以治疗脑胶质瘤小鼠,可以延长小鼠存活时间,改善小鼠生存期,并且具有较小的神经系统毒性。联合治疗可以增加脑侵润淋巴细胞CD4+、CD8+T淋巴细胞比例及数量,增加了效应T细胞与调节性T细胞的比例,尤其是CD8+效应T细胞与调节性T细胞的比例,并且改变了脑胶质瘤肿瘤微环境,增加肿瘤局部IL=12、IFN-gama的表达,降低了IL-10、IL-4的表达。在体外实验中,联合治疗组中脑侵润淋巴细胞具有GL261小鼠胶质瘤细胞特异性杀伤能力,具有较强的抗肿瘤能力,尤其是CD8+T淋巴细胞在联合治疗脑胶质瘤中发挥着关键作用。