犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的食肉目中许多动物的一种急性、高度接触性的传染病，发病死亡率高达90％以上（殷震等，1997）。虽然近20年在易感动物中已经广泛性的接种CDV疫苗，但随着生态环境的改变、动物的进化以及CDV毒株的不断变异，仍有大量关于CDV弱毒疫苗引起常规免疫犬爆发CD病情或疫情的报道(Simon-Martínez J，2008)，因此CD目前仍对犬、毛皮类经济动物养殖以及野生动物保护造成严重危害的重大疫病之一(Takayama et al，2009;Krakowka et al，1982)。　　 CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，为有囊膜不分节片的负义线性RNA病毒，被认为只有一个血清型（陆承平，2011）。病毒颗粒主要由核衣壳蛋白(N)、血凝蛋白(H)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)、基质膜蛋白(M)和磷蛋白(P)组成（殷震等，1997）。其中N蛋白是含量最多且保守性最强的免疫原性蛋白。H蛋白和F蛋白在CD的免疫和预防方面起着重要作用。CDV具有广泛的组织细胞嗜性，可感染多种细胞和组织，其中亲嗜最强的是上皮细胞和淋巴细胞，一旦发病严重破坏机体的体液免疫和细胞免疫，导致免疫抑制，并引起其它细菌或病毒病的混合感染。因此，犬瘟热的及早发现和快速准确地诊断，是犬瘟热治疗和防控的关键，获得简便、快速、敏感、实用的CDV快速检测方法仍是亟需解决的问题。　　 迄今，已报道检测CDV的方法有病毒分离、包涵体检查法、琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光抗体技术、免疫组化技术、RT-PCR方法等(Sun Z et al，2010; Hoylandet al，2003)，但这些方法存在着繁琐或重复性差等缺点，对试验人员和试验条件要求较高，难以在基层推广应用。本实验旨在建立单克隆抗体(MAb)夹心ELISA检测方法和胶体金免疫层析试纸条，为CDV的快速检测提供技术支撑。　　 1.犬瘟热MAb的制备　　 本研究利用前期从非典型CD病犬组织（肝脏、脾脏）中分离的CDVNJ01株作为免疫原，采用蔗糖密度梯度离心法提纯CDV。用纯化后CDV免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞株，并通过间接ELISA方法进行筛选，获得4株能稳定分泌抗CDV抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A2、H4、F7和G12。4株杂交瘤细胞株特异性检测:间接免疫荧光(IFA)检测结果显示，4株MAb能与感染CDV的Vero细胞反应，出现绿色荧光，而与未接毒的Vero细胞无荧光，具有较好特异性;间接ELISA交叉试验，结果证明4株杂交瘤细胞株只与CDV反应，与犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(ccv)和犬腺病毒1型(CAV-1)、Vero细胞培养物和犬阴性血清无反应，特异性良好。间接ELISA方法测定4株MAb的细胞上清和腹水效价，结果其上清的抗体效价均为103，诱生腹水的抗体效价为105～106。通过非抗原依赖方法测定杂交瘤细胞株亚类，测定结果显示这四株杂交瘤细胞株亚类均为IgG1，轻链均为κ型。通过中和实验测定中和病毒的活性，结果表明这四株MAb均具有中和病毒的能力，且MAbA2和G12腹水的中和效价为104。　　 2.单抗夹心ELISA检测方法的建立　　 通过相加ELISA试验对获得的4株MAb的抗原表位进行分析，试验证明这4株MAb针对不同抗原表位。选取相加指数最高的两株MAb G12、A2来建立双抗体夹心ELISA检测方法，通过配对试验，确定捕获抗体和酶标抗体。通过Protein G亲和层析柱对G12和A2腹水进行纯化，采用过碘酸钠标记法，用HRP标记纯化的MAb A2，以A2-HRP酶标抗体复合物为检测抗体，纯化MAb G12为捕获抗体，建立检测方法。通过优化试验条件确定A2-HRP，G12的最佳工作浓度，工作条件及工作时间。用优化后的夹心ELISA方法同步检测CDV、犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(ccv)和犬腺病毒1型(CAV-1)、Vero细胞培养物和犬阴性血清，检验该方法的特异性，试验表明该夹心ELISA检测方法具有良好特异性。将纯化CDV稀释成不同浓度，用建立的方法检测，以读取的OD450nm值为纵坐标，抗原稀释浓度做横坐标绘制标准曲线，确定该方法的灵敏度。采用同批次和不同批次包被的ELISA板条，分别检测临床20份犬眼鼻分泌物样品（CDV阳性和阴性各10份），计算批内、批间变异系数，测得其变异系数小于6％，显示该方法具有良好的重复性。用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品，两种方法的符合率为100％。本实验建立的单抗夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点，适用于大批量临床样品检测。　　 3.胶体金免疫层析试纸条的研制　　 同上采用MAb A2和MAb G12建立胶体金免疫层析检测方法。将纯化的MAb A2做为标记抗体，通过柠檬酸三钠还原法制备金颗粒-A2复合物，并将此复合物固定于玻璃纤维素膜上。将纯化的MAbG12做为捕获抗体，固定于硝酸纤维素(NC)膜上做为检测线，同样将羊抗鼠IgG抗体固定于NC膜上做为对照线，组装成CDV胶体金免疫层析检测试纸条。采用优化试验条件后的胶体金免疫层析试纸条同步检测CDV、CPV、CPIV、CAV-1、CCV、Vero细胞培养物和犬阴性血清，试验表明该方法具有良好的特异性。用该试纸条可特异检测纯化后CDV，最低可检测出20μg/ml病毒，在5min内可得出检测结果，特异性强，便于CDV的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。