非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种烈性传染病,其症状主要为高热、呼吸障碍、全身各组织器官严重出血,感染强毒株者死亡率可高达100%。此病自2018年进入我国以来,对我国养猪业造成了严重打击。目前我国学者通过解析ASFV的精细三维结构,为疫苗研发提供重要的理论基础;另一方面,高效、准确的检测方法对于控制该病具有重要意义。检测结果的准确性需要依靠高度特异的抗原或抗体,单克隆抗体技术自问世以来就广泛地作为疾病的检测手段,该种抗体只针对一种抗原表位,其灵敏度高、特异性好,能够准确的对疾病进行检测。本研究以p72蛋白为研究对象,以获取稳定、特异性好的单克隆抗体为目的,开展了相关研究,主要内容如下:1.ASFV p72蛋白的原核表达及纯化本研究根据NCBI中已发表的Georgia 2007/1毒株序列,人工合成p72全基因序列,成功构建原核表达重组质粒pET-30a-p72,利用原核表达系统成功获得了以包涵体形式表达的p72蛋白,变性、复性及透析处理后,经SDS-PAGE检测,得到了纯度较高的p72蛋白,测得蛋白浓度为1.13 mg/mL,为后续制备单抗工作奠定了基础。2.ASFV p72蛋白的真核表达及分析为了获得真核表达的p72蛋白,以用于后期单抗的验证试验,本研究构建了真核表达重组质粒pCAGGS-HA-p72,并通过转染293T细胞进行表达,24h后收取样本进行Western Blot分析,结果显示,真核表达的p72蛋白具有很好的特异性,为单克隆抗体的验证试验奠定了基础。3.ASFV p72蛋白单克隆抗体制备用原核表达并纯化的p72蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过三次亚克隆后结合IFA及Western Blot验证,最终得到了一株稳定分泌抗p72蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,将其命名为3E5,经抗体亚型鉴定为IgM型,特异性检验表明与其他常见疾病无交叉反应,特异性强。