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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染与肝癌的发生具有十分密切的关系,乙肝病毒X蛋白(HBx)在肝癌的发生发展中具有十分重要的作用。然而,HBx的致癌作用机理目前仍不十分清楚。我们实验室前期研究工作发现,在HBx导致的恶性转化过程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成复合物协同发挥转化功能,HBx和survivin扮演了至关重要的角色,HBXIP不但发挥桥梁功能连接HBx和survivin,使三者形成复合物；而且本身还具有重要的致癌作用。为了进一步阐明HBx与肝癌发病的关系,本研究应用人正常肝细胞系,探讨了HBx和survivin对HBXIP的上调作用,对其分子机制进行了详细研究。
主要研究内容分为三个部分:
一、HBXIP基因启动子的鉴定及其功能分析
实验室前期工作建立了稳定转染HBX基因和survivin基因的细胞系,分别命名为LO2-X、L-O2-S和L-O2-X-S,以此作为研究HBXIP启动子的细胞模型。为了筛选HBXIP基因启动子的功能片段,以细胞基因组为模板,通过NCBI筛选出HBXIP基因转录起始位点上游序列并设计多对引物,PCR扩增后将其产物连接到T载体进行测序鉴定；测序成功后将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上；瞬时转染LO2-X-S、H74O2、HepG2等细胞系,然后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果显示,P-3233/-1673(包含CREB结合位点)的荧光素酶活性是pGL3-Basic的8倍以上,而其他启动子片段(不包含CREB结合位点)荧光素酶活性则相对较低。这表明P-32331/-1673区域内存在调节HBXIP转录的顺时作用元件,同时CREB结合位点可能在HBXIP的转录活性调控中起一定作用。
二、HBx和survivin对HBXIP启动子甲基化水平的影响分析
本实验室的前期研究工作已证明HBXIP发挥桥梁的功能连接HBx和survivin使三者形成复合物导致正常肝细胞发生恶性转化。我们在共转HBx和survivin的细胞系LO2-X-S中通过RT-PCR发现HBXIP在mRNA水平上调,免疫印迹技术发现HBXIP蛋白表达水平上调。为了在表观遗传修饰水平阐明HBx和survivin协同上调HBXIP的分子机制,我们应用硫酸盐DNA测序法检测了HBXIP启动子的甲基化水平。结果显示,相对于LO2,LO2-X,LO2-S细胞系,LO2-X-S细胞系中HBXIP启动子的三个CpG岛-2165/-2171,-2282/-2287和-2326/-2330处于低甲基化状态,这与HBXIP表达上调相一致。该结果表明,HBx和survivin可共同诱导HBXIP启动子区域的去甲基化从而促进其表达。
三、HBx和survivin通过CREB转录因子促进HBXIP的转录
已有文献报道HBx蛋白可与转录因子cAMP应答元件结合蛋(cAMPresponse element-binding protein,CREB)结合来调节其靶基因的转录。我们通过对HBXIP启动子序列分析发现,HBXIP启动子序列中含有cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)。本研究应用染色质免疫共沉淀检测发现,HBx蛋白可与HBXIP基因相结合,但干扰CREB后HBx蛋白则不能与HBXIP基因结合。说明HBx蛋白可通过转录因子CREB来调控HBXIP的表达。那么survivin在该过程中发挥什么作用呢?为了说明这一问题,我们将survivin干扰后用HBx蛋白的抗体做染色质免疫共沉淀分析发现,survivin干扰后HBx与HBXIP基因的结合受到影响,该结果说明survivin在这一过程中也起到了重要的功能。
综上所述,HBx与survivin协同,从启动子DNA甲基化修饰和蛋白质-DNA结合等方面上调HBXIP的表达。上述研究将为深入揭示HBx的致癌机理提供新的实验依据,并进一步丰富HBx致癌的分子机理,对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论价值。