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多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)WLY78拥有目前已知最小的固氮基因簇,含有9个固氮基因(nifBnifHnifDnifKnifEnifNnifXhesAnifV),该固氮基因簇可以使大肠杆菌也具有固氮能力,但重组大肠杆菌中的固氮酶活性水、平只有原固氮类芽孢杆菌中的10%左右。同时,与其它固氮微生物类似,类芽孢杆菌中的固氮作用受环境中氧和铵的严格调控,即高浓度的氧和铵会抑制固氮作用,但其具体调控机制尚不明确。本研究以固氮类芽孢杆菌WLY78和重组大肠杆菌(携带固氮类芽孢杆菌的固氮基因簇)为材料,采用转录组比较分析的方法,探究在固氮条件(无铵无氧)和非固氮条件(100 mM NH4Cl和空气)下,固氮基因和固氮相关基因在原宿主固氮类芽孢杆菌和异源宿主大肠杆菌中的差异表达情况。通过研究发现类芽孢杆菌中固氮(nif)基因转录单元在固氮条件下被高度诱导表达,与固氮作用特异相关的非固氮基因,如运输Fe、S、Mo及电子转运蛋白相关基因以及Fe-S簇装配系统基因与固氮基因协同转录。而在重组大肠杆菌中,虽然在固氮条件和非固氮条件下类芽孢杆菌中的nif基因均高水平转录,但是固氮条件下Fe2+/Fe3+转运蛋白、电子传递蛋白和Fe-S簇装配系统相关基因的转录水平较低。这些研究结果为利用合成生物学方法构建固氮菌种和提高异源宿主的固氮酶活性提供有价值的线索和思路。基于转录组数据的分析,发现固氮类芽孢杆菌中有4个编码厌氧调控蛋白的fnr基因在固氮条件下显著上调表达。fnr基因编码的FNR蛋白是一种厌氧调控蛋白,其功能在枯草芽孢杆菌中具有比较深入的研究。为了阐明fnr基因在类芽孢杆菌固氮中的作用,基于同源重组技术,4个fnr基因的单缺失和多缺失突变株及互补菌株被成功构建。另外,通过序列比对及多项表型分析,发现fnr1和fnr3基因与枯草芽孢杆菌fnr基因在结构和功能上较为相似,并对类芽孢杆菌固氮酶活性影响较大。qRT-PCR和nif启动子带动的半乳糖苷酶活性分析表明,fnr基因的缺失使nif基因簇转录及表达水平显著降低。进一步通过FNR结合位点预测和△fnr13双缺失突变株转录组测序分析发现,fnr1和fnr3基因可以作为多效调控因子对nif基因簇、铁转运基因、呼吸及能量代谢、电子传递和碳代谢等多种途径进行激活或抑制调控,并进一步通过凝胶阻滞(EMSA)实验证明,FNR1和FNR3可以与呼吸及能量代谢基因(qoxABCD、narGHJI、ndh和resDE)、电子传递相关基因(hydEG和hemN3)和碳代谢基因(nrdDG和pflBA)等8个基因或操纵子的启动子区结合,预示着FNR对这些基因进行直接调控;EMSA实验结果同时显示FNR不与nif基因簇及铁转运基因的启动子区结合,表明FNR进行间接调控。本研究揭示了 FNR1和FNR3调控蛋白的功能,为进一步研究类芽孢杆菌的氧调控机制奠定了基础。