【摘 要】
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本文以提高SAM胞内积累量为目的,综合应用现代基因工程技术,开展了SAM合成酶基因的克隆、改组与表达研究.在本试验中,我们通过PCR方法扩增得到三个SAM合成酶基因saml、sam2和
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本文以提高SAM胞内积累量为目的,综合应用现代基因工程技术,开展了SAM合成酶基因的克隆、改组与表达研究.在本试验中,我们通过PCR方法扩增得到三个SAM合成酶基因saml、sam2和metK,然后分别插入pSE380载体并转化E. coli BL21.通过IPTG诱导可以获得各基因的蛋白质表达.三个目的基因被分别克隆进pYES2并转化酿酒酵母INVScI菌株,诱导表达后,工程菌株蛋白质表达量和胞内SAM积累量都有不同程度的提高.本论文建立了一种新的基因改组方法,可以将StEP和error-prone PCR有机的结合在一起,并成功的运用该方法对sam1进行基因改组.经过一轮反应过程,蛋白质表达量和胞内SAM积累量均明显增加.本论文建立了一种新的基因改组方法:分组-混合法,运用该方法可以将三种独立的基因改组过程整合进一个反应体系中.这一机制尤其适用于低同源性基因间的改组.本论文建立起了一种改进的重叠PCR方法(MOE-PCR),该方法可以快速、高效的实现单个基因的多点定位突变.应用这一方法,仅需要一轮反应,就成功的实现了对sam1基因8个稀有密码子的改造.
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