重组E.coli_CtSAPDH细胞催化生物基呋喃醛选择性氧化的研究

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糠醛和5-甲氧基甲基糠醛(5-methoxymethylfurfural,MMF)是重要的生物基平台化合物,可以由碳水化合物脱水制备得到。MMF及糠醛中均含有甲酰基,可分别被选择性氧化成5-甲氧基甲基-2-糠酸(5-methoxymethyl-2-furancarboxylic acid,MMFA)及糠酸。这两种产物是制备香料、药物、农业化学品、光电材料及合成纤维的重要中间体。目前,化学法仍是合成MMFA和糠酸的主流方式,但该法存在环境不友好、选择性欠佳、能耗高及反应条件苛刻等问题。而生物催化能有效解决上述问题,符合绿色可持续的发展理念,有望取代化学法用于糠酸及其类似物的合成。最近本实验室分离得到一株可高效催化5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furfural,HMF)氧化的Comamonas testosteroni SC1588,随后从中发掘出一个可高效催化HMF氧化的3-琥珀酰半醛-吡啶脱氢酶(3-succinoylsemialdehyde-pyridine dehydrogenase,SAPDH)基因,并成功构建出E.coliCtSAPDH。当前,关于SAPDH的研究仍较少,仅有关于降解尼古丁及生产降压药原料3-琥珀酰吡啶的报道。基于上述情况,本论文将重组E.coliCtSAPDH细胞用于生物基呋喃醛的氧化中,系统地研究了诱导及反应条件对E.coliCtSAPDH催化糠醛及MMF氧化的影响,建立了高效、高选择性合成糠酸及MMFA的生物催化途径;对比研究了糠醛、HMF、MMF及其相应羧酸衍生物对重组菌细胞的毒性及抑制作用。结果表明,诱导条件中诱导温度是影响重组菌细胞催化糠醛氧化性能最显著的条件;最适诱导温度是30℃。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导时间对重组菌催化活性影响甚微。E.coliCtSAPDH细胞催化糠醛氧化的最适反应温度和pH范围分别为30℃和pH 7.0-8.0。在最适反应条件下,该重组菌对糠醛及HMF的耐受水平约为100 mM。当底物浓度低于100 mM时,糠酸及5-羟甲基-2-糠酸(5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid,HMFCA)产率达95-98%。借助底物分批流加策略,该重组菌能在96 h内合成147 mM糠酸,时空产率约为4.2 g·L-1·d-1。当以MMF为底物时,该菌能在20.5 h内合成242 mM MMFA,时空产率达44.2 g·L-1·d-1。此外,该重组菌还能催化其他呋喃醛及一系列苯甲醛衍生物选择性氧化合成相应的羧酸,产率最高达100%。全细胞催化MMFA合成体系被放大到50 mL规模,结果表明200 mM MMF在6 h内被完全转化,生成174 mM MMFA,时空产率达到108.5 g·L-1·d-1;目标产物经有机溶剂萃取后,MMFA回收率约为97%,纯度为85%。此外,我们还对比了HMF、MMF及糠醛对重组菌的细胞毒性及抑制作用。发现三者对重组菌的毒性及抑制作用强弱顺序均为:糠醛>MMF>HMF。产物HMFCA、MMFA、糠酸对重组菌的细胞的毒副作用主要源于其酸性;三者对细胞抑制及毒性作用强弱顺序均为:糠酸>MMFA>HMFCA。本研究拓展了SAPDH在合成化学种的应用范畴,初步阐明了重组菌E.coliCtSAPDH催化呋喃醛氧化的反应特性及规律,揭示了三种呋喃醛及相应的羧酸衍生物对细胞的毒性及抑制作用。该研究不仅丰富了生物基平台化合物转化的相关理论知识,而且还将为高附加值呋喃衍生物的大规模制备奠定技术基础。
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