感染是烧伤后的一种常见严重并发症,细菌是感染最常见的病原体。近年来抗生素的滥用使现有的抗生素失效,并加速了耐药菌的出现和扩散。根据耐受抗生素种类的数量,耐药菌分为耐药、多耐药(multi-drug resistant)、泛耐药(extensively-drug resistant)甚至是全耐药的(pan-drug resistant)。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是目前烧伤分离率最高的致病菌,均有非常强的适应能力和广泛的抗生素耐药性。由于新型抗生素的研究发展速度远远滞后于细菌的突变速度,这使得泛耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的感染治疗相当困难。自从1915年首次发现噬菌体后不久,人们就成功地将噬菌体应用到泛耐药菌感染的治疗中。自然界中作为细菌的天敌,噬菌体的数目是细菌的十倍以上。然而目前已测序的噬菌体只有一千多种,人们对噬菌体-宿主之间的相互作用及噬菌体基因功能和作用机制的了解更是冰山一角。这些知识的匮乏阻碍了人们对噬菌体这一巨大的抗菌资源的利用。因此,为了充分利用噬菌体对抗形势严峻的烧伤后泛耐药菌感染,我们迫切地需要对噬菌体-宿主相互作用及噬菌体基因的功能和作用机制有更深入地了解。以下为本文的主要研究内容及结果:第一部分鲍曼不动杆菌噬菌体-宿主相互作用研究:1.我们进行了鲍曼不动杆菌AB1噬菌体φAbp1感染后的转录组测序(RNA-seq),从转录组水平描述在宿主菌中φAbp1感染期间与宿主的相互作用。结果显示,φAbp1基因的表达与普通的裂解性噬菌体模式不同:在φAbp1进入宿主菌后的中期(10分钟),所有φAbp1中间基因的表达达到峰值,此时φAbp1通过调节越来越多的宿主差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)开始劫持细胞资源。大多数宿主基因在整个感染过程中组成性表达,只有少部分(约六分之一)宿主基因受到了噬菌体调控,其中上调的宿主DEGs显著超过下调的DEGs,并且在不同阶段这些受调控的DEGs的功能分组是有明显区别的,这表明φAbp1是精确地控制而不是简单地禁止宿主基因。同时,从临床角度来看,噬菌体“治疗”宿主菌时,引起了宿主菌毒力和耐药基因的明显变化,这警示我们在未来使用噬菌体疗法时需要仔细考虑此方面可能产生的副作用。第二部分铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68功能机制研究:2.课题组前期研究发现铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3的orf67/orf68/orf69基因簇在噬菌体-宿主相互作用网络中处于核心调控位置。将铜绿假单胞菌PA3导入pHerdB20Torf67/orf68/orf69质粒后,我们发现orf67/orf68/orf69基因簇可以抑制宿主菌PA3的生长,其中orf68对生长的抑制效果最为明显,我们将orf68的基因产物命名为Gp68。进一步的研究发现表达Gp68的PA3宿主菌生长速度抑制主要是由于细胞分裂受抑制导致的。通过对单独过表达Gp68的PA3宿主菌进行RNA-seq发现这种分裂抑制作用与宿主菌中控制分裂的minD基因高度相关;且敲除和回补这个基因证明Gp68确实通过minD抑制细菌分裂。但作为一个核心控制基因,Gp68的功能显然不仅限于此。3.我们发现PA3菌体中表达Gp68后不再合成绿脓菌素(pyocyanin)。绿脓菌素是铜绿假单胞菌及其毒力的重要标志和重要原因,且绿脓菌素的生产是受到群体感应系统(Quorum-sensing System)复杂调控的。因此绿脓菌素合成的缺失,暗示Gp68还可以影响铜绿假单胞菌的群体感应系统,从而影响宿主菌的毒力和耐药性等能力。进一步的研究证实Gp68通过上调转录因子mvaT基因,抑制了宿主菌PA3全部群体感应系统基因的表达,从而抑制了宿主菌PA3绿脓菌素的合成,并抑制了PA3的毒力和耐药性。4.联用多种方法综合分析铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68对宿主菌的影响:在第三、四章中联合RNA-seq、表型分析和CRISPR基因敲除的基础上,进一步利用CHIP-seq、基因报告系统等技术确定Gp68是一种转录增强子结合蛋白,在宿主基因组上具有广泛的结合位点。这种成套研究思路可以扩展应用于对其他噬菌体基因功能和机制的研究。综上所述,我们对鲍曼不动杆菌φAbp1治疗宿主菌AB1时全基因组转录水平的影响有了深入的了解,探讨了噬菌体治疗时对宿主菌毒力及抗生素耐药性的影响,这将有助于我们更好地了解噬菌体疗法对宿主菌产生的各方面影响。我们绘制的基因水平的噬菌体φAbp1-AB1宿主相互作用网络,为后续噬菌体抑菌蛋白的筛选以及噬菌体-宿主相互作用的深入解析提供了研究基础。此外我们对铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68的功能及作用机制进行了研究,发现Gp68可以强力抑制细菌分裂,减弱细菌毒力和耐药性,并证实了Gp68通过转录增强作用,促进宿主的负调控基因,完成噬菌体接管(take-over)宿主的新机制。对于Gp68作用机制的研究思路可以作为未来噬菌体基因功能研究的基本思路的参考。