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本研究比较了不同碳纳米载体复合物的载药性能,筛选载药性能较好的氧化石墨烯（graphene oxide,GO）作为载体,通过在其表面修饰Toll样受体（toll-likereceptor,TLR）4抗体蛋白（TLR4antibody,Anti-TLR4）、荧光素标记的半胱天冬酶（Caspase）-3特异性底物肽（Pep）,负载羟基喜树碱（hydroxycamptothecin,HCPT）或芦荟大黄素（aloe-emodin,AE）完成GO纳米载药复合物的制备,探讨了其在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导乳腺炎中的作用。研究内容如下:1功能化碳纳米载药复合物的制备及性能研究本章试验进行了多种羧基化碳纳米管（carbonnanotube,CNTs）纳米载药复合物和GO纳米载药复合物的制备及性能研究。试验首先将壳聚糖（chitosan,CS）共价修饰于GO和多种羧基化CNTs表面,进一步缩合用于示踪的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）和用于靶向细胞膜上TLR4的Anti-TLR4,负载HCPT或AE以合成碳纳米载药复合物。紫外可见吸收光谱（ultraviolet visible absorption spectrum,UV-vis）和Zeta电位对碳纳米复合物进行表征;UV-vis研究碳纳米载体复合物的载药性能以及 GO 纳米载药复合物（GO/CS/FITC/Anti-TLR4/HCPT 或 GO/CS/FITC/Anti-TLR4/AE）中HCPT（或AE）的体外释放。研究结果表明:各种表征数据证实CS、FITC和Anti-TLR4被成功修饰在碳纳米材料表面。相比多种CNTs纳米载体复合物,GO纳米载体复合物有较高的载药能力（the drugloading capacity,LC）和载药效率（the drug loading efficiency,LE）,GO/CS/FITC/Anti-TLR4/HCPT 中 HCPT 的 LC 为 1.52 mg/mg,LE为92.95%,GO/CS/FITC/Anti-TLR4/AE 中 AE 的 LC 为 1.35 mg/mg,LE为88.57%。GO纳米载药复合物在酸性条件（pH=5.8）下,24h时HCPT和AE累计释放率为53.40%和59.58%,在中碱性条件（pH=7.4和pH=8.0）下,HCPT累计释放率为10.65%和6.45%,AE累计释放率为14.81%和7.89%。以上结果说明:GO纳米载体复合物载药性能良好,药物体外释放具有pH依赖性。因此,选择GO作为载体进行后续的研究。2功能化GO纳米载药复合物的制备及性能研究本章试验使用Pep代替第一章中的FITC,构建适用于凋亡中关键节点蛋白Caspase-3活性检测的GO纳米载体复合物（GO/CS/Pep/Anti-TLR4）,进一步负载HCPT（或 AE）合成 GO 纳米载药复合物（GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT 或 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE）。UV-vis、Zeta 电位和透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）对GO纳米载药复合物进行表征;荧光分光光度计检测GO纳米载体复合物对活性Caspase-3的荧光响应;UV-vis研究GO纳米载药复合物的载药性能及药物的体外释放。研究结果表明:UV-vis、Zeta电位和TEM表征数据证实GO纳米载药复合物制备成功。在450nm激发下,Pep在515 nm处有较强的荧光信号,而GO/CS/Pep/Anti-TLR4荧光信号明显降低;存在活性Caspase-3蛋白时,FAM荧光恢复,加入Caspase-3抑制剂后荧光消失。GO纳米载体复合物与活性Caspase-3孵育的最佳时间60 min,Caspase-3在0.5～5.0U/mL浓度范围,荧光强度呈线性增加,相关系数R2为0.99398。GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT 中 HCPT 的 LC 为 1.68 mg/mg,LE 为 94.31%,GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE 中 AE 的 LC 为 1.50 mg/mg,LE 为 95.58%。药物体外释放结果显示在酸性条件（pH=5.8）下,24 h时HCPT和AE累计释放率分别为65.47%和63.20%,在中碱性条件（pH=7.4和pH=8.0）下,24h时HCPT累计释放率为20.75%和10.94%,AE累计释放率为20.65%和12.71%。以上结果表明:GO纳米载药复合物制备成功;GO/CS/Pep/Anti-TLR4具有Caspase-3特异性荧光响应和良好的载药性能;GO纳米载药复合物中药物体外释放具有pH依赖性。3功能化GO纳米载药复合物通过诱导凋亡缓解LPS引发的乳腺炎症本章分别以LPS刺激的牛乳腺上皮细胞系（bovine mammary epithelial cell line,MAC-T）和LPS灌注的ICR小鼠为研究对象,探讨了 GO纳米载药复合物在LPS诱导的乳腺炎症中的作用。CCK-8检测GO纳米载体及GO纳米载药复合物的细胞毒性;Caspase-3活性检测试剂盒检测GO纳米载药复合物作用MAC-T细胞后Caspase-3的活性;流式细胞术检测GO纳米载药复合物作用MAC-T细胞后凋亡情况;激光共聚焦监测GO纳米载药复合物的靶向递送以及细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测 MAC-T 细胞培养上清及乳腺组织中肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）的含量以及 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）的活性。研究结果表明:0～50 μg/mL浓度范围内的 GO/CS/Pep/Anti-TLR4 没有细胞毒性;1 μg/mL 的 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT 作用细胞 24h,有明显的细胞毒性（P＜0.05）;10 μg/mL 的 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE作用细胞12 h和24 h,均有明显的细胞毒性（P＜0.05）。Caspase-3活性检测结果显示GO纳米载药复合物作用在LPS预处理的MAC-T细胞后,Caspas-3活性显著增加（P＜0.05）;流式细胞术检测结果显示LPS+GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT组（或 LPS+GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE 组）细胞凋亡率高于 GO/CS/Pep/Anti-TLR4,LPS和空白组。激光共聚焦结果显示,GO/CS/Pep/Anti-TLR4作用MAC-T细胞12 h后,未检测到绿色FAM荧光（细胞凋亡信号）。而相同处理时,GO/CS/Pep/HCPT（或GO/CS/Pep/AE）绿色 FAM 荧光较 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT（或 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE）有所减弱。GO纳米载药复合物与10 μg/mL LPS预处理的MAC-T细胞孵育3h后,细胞核观察到蓝色药物荧光（HCPT或AE信号）,细胞质有绿色FAM荧光;孵育6 h后,绿色FAM荧光明显增加,并观察到微弱的红色PI荧光（死亡细胞信号）;孵育12h后,绿色FAM荧光和红色PI荧光明显增加。在LPS诱导的MAC-T细胞培养上清及LPS灌注的小鼠乳腺组织中,TNF-α、IL-6的含量以及NAGase、LDH 的活性显著上升（P＜0.05）,加入 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT（或GO/CS/Pep/Anti-TLR4/AE）后,TNF-α、IL-6 的含量以及 NAGase、LDH 的活性显著下降（P＜0.05）。以上结果表明:在0～50μ/mL的浓度范围内,GO纳米载体复合物无细胞毒性;GO纳米载药复合物具有靶向作用,可诱导并监测细胞凋亡的不同阶段,减少TNF-α、IL-6的含量以及降低NAGase、LDH的活性。综上所述,GO纳米载药复合物能诱导并实时监测MAC-T细胞凋亡,同时在一定程度上缓解LPS引起的炎性反应。