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糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重的并发症之一,已成为终末期肾脏疾病的主要诱因。目前,常用的抗DN药物如血管紧张素转换酶抑制剂等存在较多不良反应,有必要开展新的治疗药物的研究。蝉拟青霉是一种药食两用真菌,能降低尿蛋白、血清肌酐含量,保护肾脏。黄芪为补气中药,能保护肾小球足细胞,延缓DN。但临床上黄芪用量较大,其中的大分子物质无法被机体消化吸收,限制了黄芪的药效。利用微生物发酵中药可以通过微生物的生物转化来增强其功效。将蝉拟青霉作为发酵菌种,对黄芪药材进行发酵,一方面可利用蝉拟青霉的生长代谢对黄芪所含成分进行转化,从而实现增效作用,同时也能发挥蝉拟青霉与黄芪的协同作用。为此,本文采用蝉拟青霉对黄芪进行固态发酵,以DN小鼠为模型评价发酵产物的药效作用并将其与黄芪进行比较,进一步探讨发酵物对小鼠肠道菌群的影响以及对肾小球足细胞的作用机制,以期为抗DN药物的研发提供参考。本文的主要研究内容如下:(1)制备黄芪-蝉拟青霉固态发酵物(Radix astragli-Paecilomyces cicadae solid fermentation product,RPF),利用HPLC检测RPF水提物中的成分,并比较其与黄芪所含成分的差异。结果显示,RPF中化学成分较黄芪显著增加。定量检测5种活性物质的变化情况,发现与黄芪相比,RPF中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量显著降低,毛蕊异黄酮无明显变化,RPF中的虫草酸和N-6(2-羟乙基)腺苷来自于蝉拟青霉的生长代谢。上述结果表明,蝉拟青霉在发酵过程中对黄芪中的物质进行了转化。(2)采用高脂高糖饲料联合STZ诱导建立DN模型小鼠,以盐酸二甲双胍为阳性药,通过检测小鼠体重、饮食量、饮水量以及24小时尿蛋白定量、空腹血糖、血清肌酐、血尿素氮等肾功能生理指标,初步评价RPF对DN的改善作用。利用HE和PAS染色进行肾脏病理学检查,Western blot检测肾组织自噬活性水平,免疫组化检测足细胞标志蛋白Synaptopodin和Podocin的表达,进一步评估RPF对小鼠肾组织功能的影响。结果表明,RPF可显著增加DN小鼠体重,降低饮食量、饮水量。同时,显著降低DN小鼠24小时尿蛋白定量、空腹血糖、血清肌酐、血尿素氮等肾功能生理指标,改善肾小球组织病变,增加肾组织自噬活性,且RPF抗DN的效果优于黄芪。此外,与阳性药盐酸二甲双胍相比,RPF组小鼠24小时尿蛋白定量、空腹血糖、血清肌酐、血尿素氮等肾功能指标无显著性差异,且RPF通过靶向作用于足细胞,延缓DN。(3)为了探究RPF对足细胞的保护作用机制,体外培养条件永生性小鼠足细胞,利用高糖诱导足细胞发生损伤,以RPF作为干扰药物,检测细胞活力、凋亡率及活性氧水平,Western blot检测足细胞标志蛋白、自噬标志蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果表明RPF能增加高糖诱导的足细胞的细胞活力,降低凋亡率及活性氧水平,同时增加足细胞标志蛋白的表达量。此外,RPF可靶向增加PTEN的表达,从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,提高足细胞自噬,减轻高糖诱导的足细胞损伤。说明RPF可通过降低活性氧、增强自噬及抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来保护足细胞。(4)采用Illumina MiSeq高通量测序技术分析RPF对DN小鼠肠道微生物菌群结构和组成的影响。结果表明,与正常小鼠肠道微生物相比,DN小鼠肠道微生物多样性降低,且菌群丰度发生一定改变,如Lachnospiraceae的丰度显著升高,Prevotellaceae、Ruminococcaceae、Erysipelotrichaceae 的丰度显著下降,在给予RPF治疗后,肠道菌群的多样性及其特定菌群的丰度得到了一定程度的恢复。此外,DN小鼠的尿液、血液等肾功能指标与肠道菌群密切相关,如Helicobacteraceae、unclassified_f_Lachnospiraceae、Alistipes 与 24 小时尿蛋白定量、血清肌酐、血尿素氮含量正相关;Ruminococcaceae、Erysipelotrichaceae、Ruminococcaceae_UCG-014、Prevotellaceae_Ga6A1_group 则与它们负相关。RPF可通过调节这些菌在DN小鼠肠道中的丰度,改善肾功能指标,进而延缓DN。综上所述,本文检测了黄芪发酵前后化学成分的变化;通过体内、外药理实验考察了 RPF对DN小鼠的药效作用及基于足细胞的药效作用机制;利用高通量测序技术分析了 RPF对DN小鼠肠道菌的影响。本文研究结果初步阐释了 RPF改善DN的效果及作用机制,为抗DN药物的开发奠定了基础。