淫羊藿作为一种传统的中药记载于中国药典,其主要药效活性成分包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷四种活性黄酮苷。现代药理研究表明,淫羊藿黄酮苷除具有抗骨质疏松、治疗风湿病、关节炎的作用外,还具有提高免疫、抗肿瘤的作用。然而,淫羊藿中的这四种活性黄酮苷口服后在肠道吸收均较差,需要经肠道酶、肠道菌转化为活性更强的次级苷或苷元后,在体内吸收并发挥药效。因此,有必要在体外寻找将淫羊藿黄酮苷适宜酶解的方法,获得活性较高且易于吸收的次级苷。本课题组前期研究发现,淫羊藿黄酮苷在体外可以通过生物酶水解的作用转化为次级苷或苷元,克服了传统化学水解方法易污染产物、环境等缺点,但由于游离酶存在易失活、生产成本高等缺点,限制了酶生物转化的应用。近年来,固定化酶因其具有可持续利用,易于纯化分离,绿色、专一、高效的特点,被广泛的认为性能优于游离酶,为酶技术在中药活性成分的生物转化中提供了新的应用前景。因此,本实验采用了三种方法制备不同的固定化酶,包括海藻酸钡球固定化酶、海藻酸钡-壳聚糖核壳型固定化酶、微球固定化蜗牛酶、介孔硅固定化蜗牛酶,并对各固定化酶的酶学性质进行考察,最终筛选出生物转化淫羊藿黄酮苷的最适酶解体系,并考察了淫羊藿黄酮苷及其转化产物的体外抗肿瘤活性,为高活性淫羊藿黄酮次级苷的获取,及其抗肿瘤新药的研发奠定研究基础。本文首先对固定化酶技术及其在中药生物转化中的应用、淫羊藿黄酮类抗肿瘤的研究进展进行了文献综述。实验部分研究内容包括以下几个方面:1.海藻酸钡球固定化酶的制备及其生物转化淫羊藿黄酮本部分利用海藻酸钡进行酶固定化研究,所用酶为β-葡萄糖苷酶和蜗牛酶。我们也尝试了在海藻酸钡球固定化酶外层包裹壳聚糖膜,制备海藻酸钡核-壳聚糖膜核壳型固定化酶。实验对制备的固定化酶进行酶学性质的评价并用于生物转化淫羊藿黄酮的研究。1.1海藻酸钡球固定化酶的制备以圆整度为指标,单因素考察滴加高度、BaCl2浓度、海藻酸钠浓度对海藻酸钡球圆整度的影响,优化海藻酸钡空白球的制备工艺。以酶的包封率和结合率为指标,考察酶不同的终浓度对固定化酶包封率和结合率的影响,优化海藻酸钡球固定化酶的制备工艺。实验将酶溶液与海藻酸钠溶液混合,使海藻酸钠质量浓度为1.5%,β-葡萄糖苷酶的终浓度为0.3 mg·mL-1,蜗牛酶的终浓度为0.4 mg·mL-1时,从4.0 cm的高度将该混合液滴入1.0%的BaCl2溶液中,制备海藻酸钡球固定化酶。1.2海藻酸钡核-壳聚糖核壳型固定化酶的制备以渗透性为指标,单因素考察不同壳聚糖分子量及用量、不同三聚磷酸钠（Na-TPP）用量、不同致孔剂及用量对壳聚糖膜渗透性的影响,优化壳聚糖壳的制备工艺。实验将1.0%、12 kD的壳聚糖和4.0%的致孔剂无水氯化钠,溶于1.0%的醋酸溶液中。将制备好的海藻酸钡球固定化酶加入上述壳聚糖溶液中混合,用自制滴管将海藻酸钡球滴入1.0%的Na-TPP溶液中,即得海藻酸钡核-壳聚糖核壳型固定化酶。1.3固定化β-葡萄糖苷酶和固定化蜗牛酶的质量评价本论文考察了海藻酸钡球固定化酶和海藻酸钡-壳聚糖核壳型固定化酶的酶学性质,包括重复利用性、贮藏稳定性、热稳定性。结果表明,海藻酸钡球固定化酶和海藻酸钡-壳聚糖核壳型固定化酶重复利用性、贮藏稳定性、热稳定性均较好,无明显差异。二者相比,海藻酸钡球固定化酶的酶学性质稍好,且制备方法简便,所以实验最终选用海藻酸钡球对酶进行固定。1.4海藻酸钡球固定化酶生物转化淫羊藿黄酮（1）实验筛选得到海藻酸钡球固定化酶反应的最适条件为:固定化β-葡萄糖苷酶:在pH为5.0的磷酸缓冲盐溶液中,反应温度条件为50℃;固定化蜗牛酶:在pH为5.0的磷酸缓冲盐溶液中,反应温度条件为60℃。与游离酶相比,固定化酶对反应微环境的要求较低,适宜反应的条件范围较宽。（2）实验筛选得到海藻酸钡球固定化酶酶解淫羊藿苷的最佳过程参数为:酶与底物质量比为1:1,底物浓度为0.1 mg·mL-1,在pH为5.0的磷酸缓冲盐溶液中:固定化β-葡萄糖苷酶在50℃温度条件下,反应6 h,完全酶解淫羊藿苷;固定化蜗牛酶在60℃温度条件下,反应2h,完全酶解淫羊藿苷,并采用1H-NMR、13C-NMR对淫羊藿苷及其转化产物进行鉴定。此过程固定化蜗牛酶转化淫羊藿苷的速率约为固定化β-葡萄糖苷酶的3倍,性能更加优异,所以最终选用蜗牛酶进行固定化研究并用于转化淫羊藿黄酮苷。（3）实验筛选得到海藻酸钡球固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮的最佳过程参数为:酶与底物质量1:1,底物浓度1.0 mg·mL-1,在pH 5.0的磷酸缓冲盐溶液中,反应温度50℃条件下,反应2 h后完全酶解。2.微乳化-凝胶法制备微球固定化蜗牛酶及生物转化淫羊藿苷本部分采用微乳化-凝胶法制备微球固定化蜗牛酶,以减小固定化酶的粒径,增强转化效率。（1）微球固定化蜗牛酶的制备及质量评价考察洗涤方法、BaCl2质量分数、海藻酸钠溶液质量分数、蜗牛酶溶液终浓度对海藻酸钡微球固定化酶的影响,实验最终选择1.0%海藻酸钠溶液,1.0%的BaCl2溶液,终浓度0.4 mg.mL-1的蜗牛酶溶液制备微球固定化蜗牛酶。经蒸馏水超声30 min洗涤,重复3～5次,得到的微球采用扫描电子显微镜（SEM）观察,表面呈现出不规则的多孔结构,平均粒径为（157.33±2.01）μm（n=5）。微球固定化蜗牛酶在25℃条件下贮藏7d后,酶活力保持约80%,最长保存时间为21 d;重复使用3次,微球固定化蜗牛酶对淫羊藿苷的平均转化率为75.61%;微球固定化蜗牛酶具有较好的热稳定性和pH稳定性。（2）微球固定化酶生物转化淫羊藿苷实验筛选得到微球固定化蜗牛酶生物转化淫羊藿苷的最佳过程参数为:在温度为50℃条件下,在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中,淫羊藿苷质量浓度为0.5 mg·mL-1,酶与淫羊藿苷质量比为3:1,转化时间2 h,淫羊藿苷完全酶解。3.介孔硅固定化蜗牛酶的制备及生物转化淫羊藿黄酮苷本部分利用理化性能更佳的介孔硅作为载体进行蜗牛酶固定化的研究,以期加强固化酶的机械强度,提升固定化酶的性能。3.1介孔硅固定化蜗牛酶的制备及质量评价单因素考察介孔硅与蜗牛酶反应时间及用量比对介孔硅固定化蜗牛酶结合效率的影响,另外考察了交联剂戊二醛对介孔硅固定化蜗牛酶的性能影响。实验最终在不使用戊二醛的条件下,利用质量比为1:1的介孔硅与蜗牛酶,反应10 h,制备介孔硅固定化蜗牛酶。以淫羊藿苷为底物,在重复利用介孔硅固定化蜗牛酶6次后,其酶活力仍保持约50%;介孔硅固定化蜗牛酶在4℃条件下保存6周后,酶活力仍可保持约80%,且热稳定性好。与前两种酶固定化方法相比而言,介孔硅固定化法具有更好的酶学性质。3.2实验筛选得到介孔硅固定化蜗牛酶生物转化淫羊藿黄酮苷的最佳过程参数为:淫羊藿苷:介孔硅固定化蜗牛酶和淫羊藿苷加入pH 5.0的缓冲盐溶液中,二者质量比为1:1,在50℃温度条件下反应,反应2 h后基本反应完全。淫羊藿总黄酮:介孔硅固定化蜗牛酶和淫羊藿总黄酮加入由40%DMSO和60%pH 5.0的缓冲盐溶液组成的双相反应体系中,二者质量比为1:1。在50℃温度条件下反应,反应2 h后基本反应完全。4.淫羊藿黄酮及其转化产物体外抗肿瘤活性的测定4.1淫羊藿总黄酮及其转化产物的体外抗肿瘤活性采用MTT实验考察淫羊藿总黄酮及其固定化酶转化产物在体外对A549、HepG2、MCF-7、Hela四种肿瘤细胞的增殖抑制作用,结果显示淫羊藿总黄酮转化产物对四种细胞的细胞毒作用均强于原型苷,在四种细胞中,淫羊藿总黄酮及其转化产物对乳腺癌MCF-7细胞的作用最强。4.2淫羊藿单体黄酮及转化产物对MCF-7细胞的体外抗肿瘤活性测定采用MTT实验考察淫羊藿各黄酮单体及其固定化酶转化产物体外对MCF-7细胞的增殖抑制作用,结果显示淫羊藿各黄酮单体的转化产物对MCF-7细胞的作用强于各原型苷。其中,宝藿苷Ⅰ对MCF-7细胞的抑制作用最强。4.3淫羊藿总黄酮游离及介孔硅固定化蜗牛酶转化产物的体外抗肿瘤活性比较采用MTT实验考察淫羊藿总黄酮游离及介孔硅固定化蜗牛酶转化产物体外对A549、HepG2、MCF-7、Hela四种细胞的增殖抑制作用,结果显示淫羊藿总黄酮介孔硅固定化蜗牛酶转化产物对四种细胞的细胞毒作用均强于游离蜗牛酶的转化产物,在四种细胞中,淫羊藿总黄酮游离及介孔硅固定化蜗牛酶转化产物对MCF-7细胞的作用均最强。