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研究背景与目的:慢性肝病长期发展,可导致肝纤维化,进而发展为肝硬化。全球每年因肝硬化死亡病例约120万,我国约占其中11%,肝硬化是我国常见的疾病负担之一,而治疗手段有限。肝纤维化的最典型特征是细胞外基质（ECM）异常沉积和分布,其核心环节是肝星状细胞（HSCs）活化。阐明肝纤维化发生的分子机制,对阻断甚至逆转纤维化的发生与进展具有重大意义。ECM是调控HSCs活化和肝纤维化的关键要素之一,基质细胞蛋白为ECM主要成分之一。SPOCK1属于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPACR）家族,研究报道其在肿瘤生长、转移、存活中发挥重要作用。本研究拟探索SPOCK1在HSCs活化及肝纤维化中的作用及机制,以期为肝纤维化的干预提供新的潜在靶点。方法:第一部分:（1）生物信息学分析基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）GSE25097中正常及肝硬化组织中SPOCK1与肝纤维化指标α-SMA表达的相关性;（2）免疫组化、RT-qPCR及Western blot检测人和大鼠正常及肝硬化/肝纤维化组织中α-SMA及SPOCK1的表达;（3）原位灌流-密度梯度离心法提取大鼠原代肝星状细胞（R-HSCs）,RT-qPCR、Western blot检测静止及活化的R-HSCs中α-SMA及SPOCK1的表达;（4）免疫荧光检测人肝硬化组织及活化的R-HSCs中SPOCK1的定位。第二部分:（1）RT-qPCR及Western blot检测多种促纤维化生长因子（TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、VEGF）对SPOCK1表达的调控;（2）使用生物信息学预测分析SPOCK1基因启动子区域内的转录因子结合位点,使用RT-qPCR、Western blot、荧光素酶报告基因、Fox M1 si RNA、PI3K或ERK抑制剂、染色质免疫沉淀（Ch IP）等方法阐明HSCs中SPOCK1表达上调的机制。第三部分:（1）利用慢病毒感染,构建SPOCK1低/高表达细胞;（2）干扰SPOCK1表达后,RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell实验检测HSCs活化、增殖、迁移能力变化;（3）干扰SPOCK1表达后,使用PDGF-BB孵育,研究干扰SPOCK1对PDGF-BB促纤维化作用的影响,并检测细胞增殖、迁移相关基因（cyclin B1、cyclin D1、cyclin E1、MMP2、MMP9）的表达变化。第四部分:（1）慢病毒干扰/过表达SPOCK1,以及使用重组人SPOCK1蛋白（r SPOCK1）孵育HSCs,Western blot检测PI3K/Akt、MAPKs通路（ERK、JNK、p38）蛋白的表达及磷酸化水平变化;（2）使用抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt通路,RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell实验检测抑制PI3K/Akt通路对SPOCK1所调控的HSCs活化、增殖、迁移能力的影响,并检测细胞增殖、迁移相关基因的表达变化。第五部分:（1）免疫共沉淀（Co-IP）检测与SPOCK1结合的整合素亚型,并使用免疫荧光验证;（2）使用整合素α5和/或整合素β1的中和抗体孵育HSCs,RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell检测阻断整合素α5和/或整合素β1对r SPOCK1所调控的HSCs活化、增殖、迁移能力的影响,并检测细胞增殖、迁移相关基因及磷酸化Akt（p-Akt）的表达变化。第六部分:（1）通过尾静脉注射特异性靶向HSCs的SPOCK1干扰慢病毒（LV-SMA-sh SPOCK1-Flag）,1周后使用硫代乙酰胺（TAA）诱导建立大鼠肝纤维化模型,6周后使用免疫组化、免疫荧光双染及Western blot验证慢病毒特异性感染HSCs;（2）H＆E、Masson’s trichrome、α-SMA免疫组化、羟脯氨酸实验检测肝组织胶原沉积及含量变化;（3）测定血清ALT、AST评估肝损伤程度;（4）RT-qPCR、Western blot检测肝组织及R-HSCs中SPOCK1、α-SMA、COL1A1、cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9的表达变化,以在体内水平反映SPOCK1对HSCs活化、增殖、迁移的调控。结果:第一部分:（1）生物信息学分析显示GEO数据库（GSE25097）人正常及肝硬化组织中SPOCK1与α-SMA mRNA表达显著正相关;（2）免疫组化、RT-qPCR、Western blot证实人和大鼠肝硬化/肝纤维化组织中SPOCK1表达显著增高;（3）RT-qPCR、Western blot结果显示,与静止的R-HSCs相比,活化的R-HSCs中SPOCK1表达显著增高;（4）免疫荧光结果显示,在人肝硬化组织中,SPOCK1既在HSCs和肝细胞内表达,也存在于ECM中;而在活化的R-HSCs中,SPOCK1定位于细胞质,且其表达分布与α-SMA一致。以上结果表明,SPOCK1与肝纤维化及HSCs活化正相关,可能在肝纤维化中发挥重要作用。第二部分:（1）RT-qPCR及Western blot结果显示TGF-β1及PDGF-BB均上调SPOCK1表达,且PDGF-BB作用更显著;（2）荧光素酶报告基因实验显示PDGF-BB激活SPOCK1启动子活性;（3）序列分析显示SPOCK1启动子区域存在多种转录因子结合位点,截断突变和定点突变实验表明-1356 bp～-741 bp区域内的第一个Fox M1结合位点对于PDGF-BB激活SPOCK1启动子活性至关重要;（4）si RNA干扰Fox M1进一步证实PDGF-BB通过Fox M1上调SPOCK1表达;（5）抑制剂孵育结果显示PDGF-BB通过激活PI3K/Akt通路上调SPOCK1表达;（6）Ch IP结果证实PDGF-BB通过PI3K/Akt通路调控Fox M1与SPOCK1启动子区域直接结合。以上结果表明,PDGF-BB通过激活PI3K/Akt/Fox M1通路上调SPOCK1表达。第三部分:（1）RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell实验结果显示,干扰SPOCK1表达可下调HSCs活化相关基因（α-SMA、COL1A1）表达,抑制HSCs增殖和迁移,并下调cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9表达;（2）干扰SPOCK1表达可抑制PDGF-BB促HSC活化、增殖、迁移的作用,且下调PDGF-BB促cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9表达的作用。以上结果表明,SPOCK1参与PDGF-BB的促纤维化作用。第四部分:（1）Western blot结果显示,干扰SPOCK1表达下调p-Akt水平,而SPOCK1过表达或r SPOCK1则上调p-Akt水平,但Akt的表达、ERK、JNK、p38的表达及磷酸化无显著变化;（2）RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell实验结果显示,SPOCK1过表达或r SPOCK1上调α-SMA、COL1A1表达,促进HSCs增殖、迁移,上调cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9表达,但LY294002显著抑制SPOCK1过表达及r SPOCK1的作用。以上结果表明,SPOCK1通过激活PI3K/Akt通路促进HSCs活化、增殖、迁移。第五部分:（1）Co-IP结果证实SPOCK1与整合素α5β1结合,免疫荧光显示SPOCK1与整合素β1共定位;（2）RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell实验结果显示,使用中和抗体阻断整合素α5或整合素β1可显著抑制r SPOCK1促HSCs活化、增殖、迁移的作用,并下调cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt表达,且同时阻断整合素α5和整合素β1能发挥协同性抑制作用。以上结果表明,SPOCK1通过与整合素α5β1结合,激活PI3K/Akt通路,促进HSCs活化、增殖、迁移。第六部分:（1）免疫组化结果显示Flag阳性表达的细胞位于肝脏汇管区及窦周间隙,而在实质细胞中未见表达,组织免疫荧光结果显示Flag只在Desmin阳性的细胞中表达,Western blot结果显示Flag在LV-SMA-sh SPOCK1-Flag组R-HSCs中表达,而在对照慢病毒组R-HSCs中未见表达,表明LV-SMA-sh SPOCK1-Flag特异性感染HSCs;（2）H＆E、Masson染色及α-SMA免疫组化、羟脯氨酸实验、肝功能测定结果显示,特异性干扰HSCs中SPOCK1表达缓解TAA诱导的胶原沉积及肝功能损伤;（3）特异性干扰HSCs中SPOCK1表达在组织水平及R-HSCs水平均显著下调α-SMA、COL1A1、cyclin B1、cyclin D1、MMP2、MMP9表达。以上结果表明,特异性敲低HSCs中SPOCK1表达能缓解TAA诱导的大鼠肝纤维化。结论:SPOCK1在纤维化肝组织及活化的HSCs中显著高表达。PDGF-BB激活PI3K/Akt/Fox M1通路上调SPOCK1表达,且SPOCK1参与调控PDGF-BB的促纤维化作用。SPOCK1通过与整合素α5β1结合,激活PI3K/Akt通路,促进HSCs活化、增殖、迁移。特异性干扰HSCs中SPOCK1表达能缓解TAA诱导的大鼠肝纤维化。本研究阐明了肝纤维化发生及发展的一种新思路,或可为肝纤维化的干预提供新的潜在靶点。