目的用经过多聚赖氨酸修饰的超顺磁氧化铁纳米粒子作为基因载体,将携带碱性成纤维生长因子的绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1-bFGF转染至体外培养的猫角膜内皮细胞,并初步研究其转染效果,探讨超顺磁氧化铁纳米粒子作为一种新型基因载体进行体外角膜内皮细胞基因转染的可行性。本实验分两部分:第一部分:猫角膜内皮细胞培养及鉴定。第二部分:超顺磁氧化铁纳米粒介导pEGFP-C1-bFGF基因转染猫角膜内皮细胞及其表达的观察。方法第一部分:无菌条件下取猫龄小于3个月的猫眼球,沿角膜缘剪开取角膜片,按揭取后弹力层培养法进行角膜内皮细胞的原代及传代培养。倒置显微镜下观察不同阶段培养的细胞的形态,用台盼蓝染色计数各代活细胞的百分数。并用NSE抗体对传代培养的细胞进行鉴定,观察传代细胞是否保持有角膜内皮细胞的特性。第二部分:用多聚赖氨酸为修饰物,使多聚赖氨酸通过静电作用结合于超顺磁氧化铁纳米粒子表面,获得多聚赖氨酸-超顺磁氧化铁纳米粒子复合物(SPIONs—PLL)。借助含有报告基因的真核表达载体pEGFP-C1,用SPIONs—PLL作为基因载体,将bFGF基因转染至体外培养的猫角膜内皮细胞。在倒置荧光显微镜下观察转染效率,并继续观察bFGF基因表达情况。结果第一部分:体外成功培养原代猫角膜内皮细胞,并传到第4代。其中原代与1代细胞生长良好,细胞呈铺路石样向周边铺展扩增,大部细胞形态呈规则多边形、生长状态好,活细胞的百分数分别为99.8%,99.1%。而从2代开始的角膜内皮细胞贴壁和增殖能力开始减弱,传至3代细胞形态变大不规则、胞质内空泡渐增多,细胞数量渐少,活细胞的百分数分别为98.2%,94.3%,91.3%。传代培养的猫角膜内皮细胞用NSE鉴定,胞质内出现抗体NSE的阳性表达。第二部分:获得密度均匀的SPIONs—PLL悬浮溶液。由于SPIONs—PLL在中性溶液中带正电,颗粒彼此间存在静电斥力,可以抵消部分重力作用,所以SPIONs—PLL在久置后仍处于悬浮状态。并且成功将pEGFP-C1-bFGF基因转染入猫角膜内皮细胞,48 h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,未转染的细胞未见绿色荧光,转染细胞与未转染细胞均生长良好。经western blot检测,证明转染携带有bFGF基因质粒的细胞中bFGF基因表达显著增高。结论1、体外利用揭取后弹力层法能够成功培养出角膜内皮细胞并传代,随着细胞的传代细胞增殖能力减弱,继续传代能力差。传代细胞经NSE鉴定呈阳性表达,证明本实验所培养的角膜内皮细胞为神经嵴来源的细胞。2、经多聚赖氨酸修饰的超顺磁氧化铁纳米粒子可作为基因载体将pEGFP-C1-bFGF基因转染入猫角膜内皮细胞并得到表达,转染的细胞生长良好。且超顺磁氧化铁纳米粒子所具有的超顺磁性可达到在外加磁场条件下提高转染效率的效果。说明超顺磁氧化铁纳米粒子可作为一种新型基因载体在基因工程细胞转染方面具有较大的可行性。