茶树抗假眼小绿叶蝉相关基因的克隆及表达研究

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当植物被昆虫取食时,其转录组的变化是植物诱导抗性形成的分子基础,因此,揭示植物在受到昆虫进攻时转录组的改变是了解植物诱导抗性形成机制的重要手段。一些植物在受到昆虫取食时转录模式的变化已经被研究,这些植物包括拟南芥、烟草、柑橘、云杉和杨树等。而关于茶树这种木本常绿植物的抗虫性研究还未见报道。假眼小绿叶蝉是我国茶园的一种重要害虫,本研究的目的是分离受假眼小绿叶蝉取食诱导的基因,这些基因的表达是茶树诱导抗性形成的重要基础。为了分离受小绿叶蝉诱导而上调表达的基因,我们以假眼小绿叶蝉取食32h的茶树叶片和未被取食的茶树叶片为对比材料构建差减cDNA文库。从构建的正向差减文库中,随机挑选680个克隆,经斑点杂交筛选,得到35个阳性克隆。通过序列分析,将它们聚类为26个不同的cDNA片段。荧光定量RT-PCR结果表明其中有21个cDNA受假眼小绿叶蝉取食的诱导。我们用Cs-Ev(Cs和Ev分别代表Camellia sinensis和Empoasca vitis)来表示这些基因。在这21个基因中,Cs-Ev2和Cs-Ev20分离了2次,Cs-Ev19分离3次,其他的cDNA只有1个克隆。这21个基因按其编码产物的功能可以分为5类,编码植物防卫蛋白的基因,参与CBL-CIPK信号通路的基因,与植物次生代谢合成有关的基因,与植物氧化胁迫有关的基因,以及细胞壁蛋白基因。其中有些基因是首次从植物中分离出的受昆虫取食诱导的基因。该研究结果为人们深入了解植物与昆虫的相互作用提供了新的信息。核糖体失活蛋白(RIPs)是一种rRNA N—糖苷酶,能够专一性地水解真核生物核糖体28rRNA特定位置上的腺嘌呤(A4324)与核糖之间的N-C糖苷键。RIPs主要分为两种类型:Ⅰ型RIPs由一条具有rRNAN-糖苷酶活性的多肽链组成,是单链蛋白;Ⅱ型RIPs为一异二聚体,由一条相当于Ⅰ型RIP的A链和一条具有凝集素性质的B链组成,它们通过一个二硫键相连。在研究茶树对假眼小绿叶蝉的应答反应时,从抗假眼小绿叶蝉的茶树品种——凫早2号的叶片中分离出一个Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的全长cDNA序列和基因组DNA序列,命名为CsRIP (GenBank登录号:FJ648831)。该基因包含一个完整的ORF,编码一条由570个氨基酸残基构成的多肽链。序列比对表明Ⅱ型RIPs所有保守的氨基酸残基,均出现在CsRIP相应的位置上,其中包括构成A链N-糖苷酶活性位点的氨基酸残基和构成B链两个寡糖链结合位点的氨基酸残基。研究中还发现,CsRIP基因的表达受小绿叶蝉的诱导,但不受茶尺蠖的诱导。
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