目的角膜是眼屈光成像系统中的重要组成部分,但其作为眼睛的最外层,直接暴露在环境中,容易受到擦伤、感染、烧伤等各种因素的损害。当角膜修复的过程发生异常时,将会导致角膜水肿、新生血管及瘢痕的形成,进而造成视力不佳。由角膜混浊引起的全球盲和视力损伤也是目前国家防盲治盲的重点之一。如何有效地调控角膜损伤修复的过程,寻找一种安全有效的药物促进角膜上皮细胞的增生以及减少角膜混浊、新生血管的形成迫在眉睫。目前,已证实当角膜上皮细胞受损时,坏死的细胞会释放各种内源性因子——警报素（Alarmin）,它可以趋化炎症细胞迅速地迁移进入受损的组织,进而产生过度的炎症反应,导致角膜基质纤维化、角膜溃疡等。其中,高迁移率族蛋白1（High mobility group box 1,HMGB1）作为经典的警报素之一,被证实在角膜炎、葡萄膜炎、青光眼、糖尿病性视网膜病变和视网膜变性等疾病中可作为炎症因子加重病情的发展,而抑制HMGB1的表达和功能有望成为这些疾病新的治疗手段。本实验通过建立小鼠角膜上皮层机械性损伤模型研究HMGB1是否参与角膜损伤后的修复过程和不同时间点胞外HMGB1的表达情况,以及HMGB1在创伤修复过程中对炎症反应和Haze形成的相关调控机制。因此,我们通过检测各组小鼠的角膜上皮缺损率、角膜组织病理变化、不同时间点胞外HMGB1的表达情况、细胞增生情况、中性粒细胞的表达、炎症相关因子的表达、Haze评分以及Haze形成相关蛋白的表达,探讨胞外HMGB1在小鼠角膜损伤修复过程中的表达情况以及使用其抑制剂甘草甜素（Glycyrrhizin,GL）阻断胞外HMGB1后是否会对小鼠角膜损伤修复过程中炎症反应和Haze的形成造成影响。方法1.采用随机数字表法将105只8周龄健康C57BL/6J小鼠分为3组,分别为正常组（A）、角膜上皮损伤+PBS滴眼组（B）、角膜上皮损伤+GL滴眼组（C）,每组35只。造模前1 d,A、B组分别腹腔注射100μL的PBS溶液,C组腹腔注射100μL的2 g·L^-1GL溶液。造模时,A组不建立角膜上皮损伤模型,B、C两组小鼠右眼建立角膜上皮层机械性损伤模型,左眼不做处理。造模后,分别对B、C两组小鼠右眼用5μL的PBS、GL点眼,每隔6h点眼1次,连续点眼3d,3d后每隔12h点眼1次,继续点眼11d。2.小鼠建立角膜上皮损伤模型后24h、48h、72h用100 g·L^-1荧光素钠溶液着染角膜观察小鼠右眼角膜上皮的缺损情况,并拍摄图像记录。造模后1周、2周对角膜透明度情况进行Haze评分,记录数据。3.小鼠建立角膜上皮损伤模型后72h,颈椎脱臼法处死小鼠,取出完整眼球,石蜡切片后行HE染色,光镜下观察各组小鼠角膜组织病理学变化。4.小鼠建立角膜上皮损伤模型后24h、48h、72h、1周、2周,颈椎脱臼法处死小鼠,取出完整眼球,石蜡切片后行免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）,分别检测各组胞外HMGB1、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、细胞增殖核抗原（nuclear-associated antigen Ki-67,Ki-67）、核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）、III型胶原蛋白（Collagen type III）等蛋白的表达。5.Western blot法检测各组小鼠不同时间点角膜组织中HMGB1、IL-1β、NF-κB、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症体（NLRP3 inflammasome）、α-SMA、FN等蛋白的表达差异。6.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）技术检测各组小鼠不同时间点角膜组织中HMGB1、NF-κB、IL-1β,趋化因子2（Chemokine2,CCL2）、C-X-C基序趋化因子配体2（C-X-C motif chemokine ligand 2,CXCL2）的m RNA相对表达含量。结果1.角膜上皮损伤后,角膜组织中HMGB1的表达情况。造模后24 h、48h、72 h,IHC染色结果显示:A组正常的角膜上皮细胞胞外和基质层均不表达HMGB1蛋白,B、C组均可见HMGB1蛋白从角膜上皮细胞的胞核中转位至胞浆、胞外,且基质层出现HMGB1蛋白的阳性表达,而应用GL治疗后,C组角膜上皮细胞胞外和基质中HMGB1蛋白的阳性表达相比B组则明显地减弱。同样地,HMGB1的RT-q PCR和Western blot结果也显示,与A组相比,在各个时间点,B、C两组角膜组织中HMGB1的m RNA、蛋白表达水平均显著地升高,而C组的增加水平则明显地低于B组。2.不同时间点角膜损伤愈合情况和Haze评分。造模后24 h、48 h、72 h,B组角膜上皮缺损率分别为（87.74±3.57）%、（32.21±4.02）%、（3.80±1.86）%;明显地高于C组的（78.75±5.81）%、（21.58±4.53）%、（0.83±0.72）%,差异均有统计学意义（均为P﹤0.01）,可见C组角膜上皮细胞增殖能力强于B组。造模后1周、2周,B组角膜的Haze评分分别为（2.50±0.54）分、（1.50±0.54）分;明显地高于C组的（1.67±0.51）分、（0.92±0.58）分,差异均有统计学意义（均为P﹤0.05）。可见C组角膜Haze程度低于B组。3.角膜组织结构修复和上皮细胞增殖情况。造模后72 h,HE染色结果显示:A组正常角膜组织结构完整,上皮层由3～5层上皮细胞构成,基质层胶原纤维排列规则紧密;B组的角膜上皮细胞生长0～2层,上皮细胞排列紊乱;而C组的角膜上皮细胞生长2～3层,上皮细胞排列欠规则。同时,造模后72h,上皮细胞Ki-67蛋白的染色结果显示:C组角膜上皮细胞的Ki-67蛋白阳性表达率为（82±3.57）%;明显高于B组的（78±4.02）%,差异有统计学意义（P﹤0.05）。两者均表明C组角膜上皮细胞增殖能力强于B组。4.角膜上皮损伤后,胞外HMGB1对IL-1β蛋白表达的调控作用。Western blot结果显示:A组正常角膜组织中不表达成熟的IL-1β蛋白,只表达IL-1β前体蛋白;造模后24h、48h、72h,B、C两组受损的角膜组织中均高表达成熟的IL-1β蛋白,而在各时间点,应用GL抑制胞外HMGB1表达和功能的C组角膜组织中成熟的IL-1β蛋白表达含量均显著低于B组。同样地,IL-1β蛋白的IHC染色也显示:A组正常角膜组织中,IL-1β蛋白仅在角膜上皮层表达,基质中不表达;B、C两组角膜上皮层和基质层均高表达IL-1β蛋白。且各时间点C组角膜基质中IL-1β蛋白阳性表达的平均高密度值（Mean optical density,MOD）均低于B组的MOD值。另外,IL-1β的RT-q PCR结果也显示:角膜受损后B、C两组角膜组织内IL-1β的m RNA水平显著地升高,而相比于B组,C组IL-1β的m RNA表达水平含量显著地降低。此外,我们通过Western blot、RT-q PCR、IHC等方法进一步深入研究胞外HMGB1是如何对IL-1β蛋白的表达进行调节,发现胞外HMGB1是通过NF-κB-P65/NLRP3信号通路来调控IL-1β的蛋白表达。5.角膜上皮损伤后,胞外HMGB1诱导中性粒细胞向角膜基质迁移,加剧受损组织的炎症损伤。造模后24h、48h、72h,MPO蛋白的IHC染色结果显示:A组正常角膜基质层中无中性粒细胞浸润。造模后24h,B、C两组均可见大量中性粒细胞从角膜缘迁移至角膜基质中;造模后48h,B、C两组角膜基质层中中性粒细胞的浸润程度达到峰值,C组为每200倍视野（93.33±3.18）个,较B组[（142.66±4.50）个]明显地减少,差异有统计学意义（P﹤0.01）。造模后72h,C组为每200倍视野（10.66±5.13）个,较B组[（40.00±6.08）个]明显地减少,差异有统计学意义（P﹤0.01）。由此可知,通过使用GL抑制胞外HMGB1的功能,C组角膜基质层的中性粒细胞浸润数量均显著低于B组。同样地,RT-q PCR的结果也显示:造模后24h、48h、72h,C组角膜组织中趋化中性粒细胞迁移的有效分子——CCL2和CXCL2的m RNA表达水平显著地低于B组。6.角膜上皮损伤后,胞外HMGB1通过调控TGF-β1的表达诱导成纤维细胞分化和Haze的形成。造模后72h、1周、2周,通过IHC染色结果显示:与A组正常角膜组织相比,72h时B组角膜基质层中出现TGF-β1蛋白的阳性表达,1周后,TGF-β1蛋白的阳性表达量持续地升高,而在各个时间点,C组应用GL抑制胞外HMGB1的功能后基质层中TGF-β1蛋白的阳性表达均显著地低于B组。同时,造模后1周、2周,B组角膜基质层中均出现α-SMA蛋白阳性表达的成熟肌成纤维细胞,且基质层中出现大量Collagen III、FN蛋白的聚集。而C组应用GL则减少了肌成纤维细胞的形成,以及基质层中Collagen III、FN胶原的异常聚集。结论当角膜上皮损伤时,其可导致角膜组织中HMGB1蛋白的异常表达。胞外HMGB1是介导中性粒细胞的迁移和细胞因子产生的重要调节分子,胞外HMGB1通过调控IL-1β的表达、中性粒细胞的迁移、肌成纤维细胞的成熟进而使损伤组织产生过度的炎症反应、延迟上皮的愈合、加重Haze程度。而GL能有效地拮抗胞外HMGB1的功能,降低损伤组织中相关细胞因子的过度表达和中性粒细胞浸润,从而减轻炎症反应,促进角膜上皮层的愈合并减轻角膜Haze。