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红曲霉(Monascus)能分泌产生红曲色素(Monascus pigment)、莫呐可琳类物质(Monacolins)、γ-氨基丁酸(y-Aminobutyric Acid, GABA)、麦角固醇、异黄酮、不饱和脂肪酸和丰富的水解酶类等多种有益生物活性物质,被广泛应用于食品和医药行业。目前对红曲霉分子生物学方面的研究比较少。本课题实验材料为一株从红曲米中筛选到的紫色红曲霉(Monascus purpureus)菌株Mp-41,根据优化后的根癌农杆菌介导的高效转化体系,建立了紫色红曲霉转化库,通过对转化子的生物学特性进行分析筛选到一批变异较大的转化子,并对其主要代谢产物-红曲色素和桔霉素进行初步研究。然后采用基因组PCR分析方法,从它们的基因组中分别扩增到两条pksCT基因启动子区部分序列和终止子区部分序列片段。主要的研究结果为：1、构建根癌农杆菌介导的菌株Mp-41的突变体库对影响转化的各因素进行优化,这些因素包括：菌株Mp-41的培养基种类、培养的时间以及孢子液的浓度；根癌农杆菌的浓度；根癌农杆菌与菌株Mp-41共培养时所用膜的类型、温度及共培养的时间；诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度。优化后所建立的高效转化体系为：Mp-41菌株在葡萄糖乙醇培养基上30℃培养,20d后收集制备浓度为104个孢子/mL的分生孢子悬浮液,诱导剂AS的浓度为100μ mol/L,根癌农杆菌的浓度为OD600=0.7,根癌农杆菌与菌株Mp-41在硝酸纤维素膜(NC膜)上共培养温度为25℃,最佳共培养时间为3d。根据此优化后的体系建立了含有1000多株转化子的突变体库。2、转化子的潮霉素抗性PCR鉴定以及遗传稳定分析在葡萄糖乙醇培养基上30℃培养突变库中的1000多株转化子,然后随机挑选60株转化子在不含潮霉素B的葡萄糖乙醇培养基上培养7d,连续6代传代培养后,再在含200μg/mL潮霉素B的葡萄糖乙醇培养基上进行培养,并将菌株Mp-41同时培养以作对照所用,观察记录转化子的生长情况,然后计算转化子的稳定性。提取转化子的DNA进行潮霉素抗性鉴定。结果表明,所选转化子在遗传上基本稳定,并且T-DNA片段均已经整合入紫色红曲霉转化子菌株中。3、转化子菌株生物学特性观察比较将1000多株紫色红曲霉转化子菌株接种到葡萄糖乙醇培养基、MEA培养基和CYA培养基上,30℃培养7d,同时接种原始菌株Mp-41作为对照,观察菌落表观形态及显微形态。结果表明,与原始菌株Mp-41相比,大部分转化子没多大变化,但是少数转化子在表观形态以及显微形态方面发生了较大变异。4、转化子菌株发酵产物桔霉素含量变化分析以及色价的检测从形态变异较大的转化子菌株中随机筛选33株转化子进行发酵培养,30℃培养7d,采用紫外-可见光扫描方法以及薄层层析等方法测定了转化子的色价并分析了转化子中桔霉素含量,结果显示,与原始菌株相比,转化子菌株的色价以及桔霉素的含量发生了不同程度的变化。分析转化子产色素能力发现,所选转化子菌株中有17株转化子菌株在505nm处的色价升高,其中转化子Mp-41-155液态发酵后色价达115.98U/mL,是Mp-41色价66.37U/mL的1.75倍,固态发酵后色价高达2628.71U/g,是原始菌株Mp-41色价1664.74U/g的1.58倍；剩下其余15株转化子菌株的色价降低,其中转化子Mp-41-62液态发酵后测得的色价只有2.71U/mL,仅为原始菌株Mp-41的0.04倍,固态发酵后色价为556.51U/g,而原始菌株Mp-41色价为1664.74U/g。此外,部分转化子在波长300-600nm处的吸收峰也发生了程度不同的变化,原始菌株Mp-41有两个吸收峰,大部分转化子如Mp-41-81、Mp-41-83、Mp-41-84、Mp-41-85、Mp-41-88、Mp-41-89、Mp-41-90、Mp-41-91、Mp-41-92、Mp-41-150、Mp-41-151、Mp-41-152、Mp-41-153、Mp-41-155、Mp-41-156、Mp-41-157、Mp-41-160、Mp-41-161、Mp-41-162、Mp-41-163、Mp-41-164、Mp-41-165、Mp-41-169均有三个明显的吸收峰,Mp-41-62和Mp-41-86均只有390-400nm左右的一个吸收峰,其余转化子菌株有两个吸收峰。分析各转化子桔霉素产能发现,有7株转化子的桔霉素含量明显降低,而且Mp-41-62和Mp-41-86两株菌株中几乎检测不出桔霉素,估计是因为这两株转化子中桔霉素含量低于TLC方法能够检测的最低值0.2μg/g。5、转化子中生物合成桔霉素基因—pksCT基因的保守性分析研究发现,红曲霉的色素的合成与桔霉素代谢调控开始于同一个生物合成途径,pksCT基因是与红曲霉桔霉素合成相关的基因,实验选择了32株转化子菌株,运用PCR方法,从它们的基因组中扩增得到启动子区部分序列和终止子区部分序列片段的两条pksCT基因,大小分别为659bp和591bp。将扩增产物测序后,再通过NCBI进行BLAST比对。结果表明,扩增到的序列之间具有高度的同源性,而且产物序列与GenBank中公布的紫色红曲霉中pksCT基因启动子区部分序列和终止子区部分序列一致。因此,pksCT基因是红曲霉中普遍存在的桔霉素合成相关的保守基因,对它的研究有助于在分子水平对红曲色素相关基因的进一步研究。