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心血管疾病的发病存在明显的性别差异。绝经前女性心血管疾病发病率明显低于男性,而绝经后这种优势丧失。绝经期妇女最显著的生理变化就是体内雌激素水平的降低,雌激素的心血管保护作用已有文献报道,然而具体机制尚未完全阐明。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是近年来发现的一类新的内源性气体信号分子。在心脏组织中,H2S是以L-半胱氨酸为底物,在胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ lyase, CSE)的催化下生成的。近年来,内源性H2S作为一种内源性心肌保护机制也受到了广泛关注。本实验室前期工作已经发现雌激素替代可以改善OVX大鼠氧化应激损伤,同时雌激素可以促进CSE表达,然而内源性H2S是否参雌激素抗心肌氧化损伤过程则尚未可知。因此,本课题首先明确了内源性H2S在雌激素抗心肌氧化应激损伤过程中的作用,进而探讨了雌激素促进心肌细胞CSE表达和H2S生成的分子机制。主要研究内容与结果如下：第一部分CSE参与了雌激素抗心肌氧化应激损伤的作用为明确内源性H2S在雌激素抗心肌氧化应激损伤过程中的作用,我们采用200μM过氧化氢(H202)处理后,新生大鼠心肌细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)和活化caspase3表达显著增多,同时细胞活力和磷酸化Akt达受到显著抑制,说明H2O2对心肌细胞造成了氧化应激损伤。而雌激素处理则可显著抑制H202所导致的心肌细胞损伤。进一步研究发现,采用CSE阻断剂PAG处理以及siRNA特异性敲低内源性CSE表达后,雌激素上述抗心肌细胞氧化应激损伤的作用被阻断。上述结果提示：内源性H2S参与了雌激素抗心肌细胞氧化应激损伤的作用。第二部分雌激素对心肌细胞中CSE表达以及内源性H2S生成的影响在体外分离培养新生SD大鼠心肌细胞中加入雌激素(10-10-10-7mol/L),通过real time PCR和western blot法检测雌激素对心肌细胞中CSE mRNA和蛋白表达的影响。结果发现雌激素能够剂量依赖性地促进心肌细胞中CSE mRNA和蛋白的表达,10nM雌激素能使CSE蛋白表达上调3倍左右。用雌激素(10-8mol/L)处理心肌细胞24h后发现：雌激素可以显著提高心肌细胞中H2S的生成率。第三部分雌激素调节心肌细胞中CSE表达的受体机制在体外培养心肌细胞中发现,雌激素受体(estrogen receptor, ER)非特异性受体阻断剂ICI182,780以及ERa特异性阻断剂MPP (Methyl-Phenol-Pyrazole)可以完全阻断雌激素上调CSE表达的效应,而ERp特异性阻断THC(Tereahydro-Chrysenediol)对雌激素上调CSE表达的作用无显著影响。用特异性针对ERa的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)片段敲低内源性ERa表达后,也可以完全阻断雌激素上调CSE表达的的作用。上述结果提示：ERa介导了雌激素上调CSE表达的作用。第四部分转录因子SPl在雌激素上调CSE表达过程中的关键作用在体外培养的新生大鼠心肌细胞中,我们发现雌激素(10-10-10-7mol/L)可以剂量依赖性地上调SP1mRNA和蛋白表达。用siRNA敲低内源性SP1表达后,CSE的基础表达显著受抑,同时雌激素上调CSE表达的效应被完全阻断。将含有SP1结合位点的PGL3-CSE启动子荧光素酶报告基因(PGL3-CSE)转染到大鼠心肌细胞系H9C2细胞后发现：转染该质粒后荧光素酶表达量明显增加,雌激素可以显著诱导PGL3-CSE启动子转录激活。为了探讨SP1结合位点是否参与了CSE的基础表达和雌激素诱导的CSE表达作用,我们构建了SP1位点突变的PGL3-CSE启动子表达质粒PGL3-CSE mutant。进一步研究发现：转染了SP1结合位点突变的PGL3-CSE mutant报告基因后,H9C2细胞的基础荧光素酶活性显著低于转染野生型CSE启动子报告基因的细胞,此外雌激素对PGL3-CSE mutant报告基因的转录激活没有显著影响。上述结果提示SP1在雌激素诱导CSE表达过程中起了关键作用。第五部分雌激素通过抑制miR22表达从而上调SP1表达已有研究发现miR-22参与SP1的转录调节。我们用雌激素(10-10-10-7mol/L)处理心肌细胞发现,雌激素可以剂量依赖性抑制miR-22表达。抑制miR-22表达可以促进SP1mRNA和蛋白表达水平,而miR-22类似物不仅可以抑制SP1的基础表达,同时可以阻断雌激素上调SP1表达的作用。提示：雌激素通过抑制miR-22表达从而上调SP1表达。第六部分雌激素通过抑制miR-22表达从而促进ERa表达对乳腺癌的研究中已经发现miR-22可以调节ERa的表达。我们采用雌激素以及miR-22类似物处理心肌细胞发现,雌激素可以上调ER的表达,而miR-22类似物不仅可以抑制ERa的基础表达,同时可以阻断雌激素上调ERa表达的作用。提示：雌激素通过抑制miR-22表达从而上调ERa表达。第七部分雌激素替代可以显著促进去卵巢大鼠心肌组织中CSE、SP1表达,抑制miR-22表达将雌性SD大鼠随机分为三组：对照组(Sham),去卵巢组(Ovx)和去卵巢+雌激素替代组(Ovx+E2)。Ovx+E2组给予雌二醇30μg/kg皮下注射,其余两组给予溶剂,两周后取左心室组织,检测CSE、SP1以及miR-22的表达的影响。研究发现去卵巢后心肌组织中CSE、SP1的表达显著下调,miR-22的表达显著上调,而雌激素替代后,CSE、SP1以及miR-22的表达恢复至假手术水平。由此说明雌激素替代可以显著促进去卵巢大鼠心肌组织中CSE、SP1表达,抑制miR-22表达。四、结论：本研究表明,内源性CSE/H2S增多在雌激素抗心肌细胞氧化损伤的过程中发挥重要作用。雌激素可以上调心肌细胞中CSE的表达,从而促进内源性H2S生成。雌激素诱导CSE表达的作用机制与其抑制miR-22表达,从而促进SP1和ERa表达有关。