聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术已经成为分子生物学研究的必备工具,在疾病诊断、法医鉴定、药品/食品微生物分析等领域发挥越来越重要的作用。但是,实际样品中可能会存在各种各样的PCR抑制剂,例如腐植酸（humic acid,HA）和钙离子(Ca2+),导致PCR效率降低甚至扩增反应失败。目前已经开发了多种方法用于常规样品中PCR抑制剂的清除,但是高浓度PCR抑制剂的清除仍存在挑战,且现有方法所需的时间较长。电膜萃取（electromembrane extraction,EME）技术是由液相微萃取（liquid-phase microextraction,LPME）技术发展而来的一种新型的样品前处理技术,具有绿色、高效、快速、选择性可控、净化能力强等特点。EME的基本原理是离子化的目标分析物在电场的驱动下实现选择性的跨膜转移。经过十五年的发展,EME技术已被广泛用于复杂样本中痕量目标分析物（如多肽、药物、毒物等）的提取和富集。但是,极少有学者将该技术用于样本中杂质/干扰物的去除,且该技术尚未涉足分子生物学尤其是DNA分析领域。针对高浓度PCR抑制剂清除的难题,结合EME技术的特点,本课题拟将EME技术引入法医遗传学和药品/食品微生物分析领域,用于含高浓度PCR抑制剂样本的纯化。本研究首先探究了两种非常有代表性的阴离子型（HA）和阳离子型(Ca2+)抑制剂对PCR的抑制作用,然后基于EME技术研究了HA和Ca2+的去除并评估了EME有机膜溶剂对PCR的潜在影响,最后通过EME技术在法医遗传学和药品/食品微生物检测中的应用验证了EME技术作为DNA样本纯化平台这一概念的可行性。本研究主要包括三个部分（不含前言部分）:第一部分腐植酸和钙离子对PCR抑制作用的探究目的:腐殖酸（HA）和钙离子(Ca2+)是两种常见的PCR抑制剂。HA是广泛存在于土壤中的一种酸性聚电解质,在常见法医物证检材如血液中呈阴离子形式且与DNA具有相似的理化性质。Ca2+在某些食物、药物和骨骼中含量丰富。为了更好的指导EME去除HA和Ca2+的相关实验,本章节利用定量PCR（quantitative PCR,qPCR）技术和法医短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析技术对HA和Ca2+造成的PCR抑制作用进行了系统的评估。方法:通过扩增曲线和熔解曲线评估不同浓度HA(0μg mL-1~200μg mL-1)对染料法qPCR的抑制作用;通过扩增曲线和熔解曲线评估不同浓度Ca2+（0 mM~100 mM）对染料法qPCR的抑制作用;通过等位基因检出情况评估不同浓度HA(0 mg mL-1~1 mg mL-1)对法医STR分析的抑制作用。结果:在本章实验条件下,HA对qPCR造成完全抑制的浓度为60μg mL-1;Ca2+对qPCR造成完全抑制的浓度为100 mM;HA对法医STR分析造成显著抑制（等位基因检出率小于50%）的浓度为0.6 mg mL-1。结论:HA和Ca2+均能对PCR造成明显的抑制,抑制程度与抑制剂的浓度有关。而且,由于抑制机制不同,HA对qPCR和STR分析造成抑制所需的浓度也有较大差别。第二部分基于电膜萃取技术探究法医遗传学DNA分析中腐植酸抑制剂的清除目的:法医样本中可能含有高浓度的腐殖酸（HA）,造成法医STR分析的失败。本章节主要探究EME清除HA的能力,及利用EME净化作用减轻PCR抑制的可行性。主要包括三个目的:（1）基于EME技术建立清除不同浓度水平HA的实验方法;（2）利用PCR技术评估EME清除HA的效果;和（3）验证EME清除HA的法医学应用价值。方法:首先选择96孔-平行EME（Parallel-EME,Pa-EME）装置进行HA清除实验,从支撑液膜（supported liquid membrane,SLM）成分、样本pH、萃取电压、萃取时间等方面对EME的主要实验条件进行优化;同时考虑HA浓度对EME清除效率的影响以及EME使用的有机溶剂对PCR的抑制作用;然后使用qPCR技术评估EME去除HA对PCR的改善作用,同时考察EME过程中DNA的保留率;最后使用法医STR分型技术对EME清除HA的能力与三种现有DNA样本纯化技术进行比较,并通过清除加标法医物证检材中的HA验证EME技术的法医学应用价值。结果:首先针对不同HA浓度的样本进行了EME技术参数的优化,以期获得最大的HA清除率。对于0.2 mg mL-1的HA溶液,以含1%甲基三辛基氯化铵的正辛醇为SLM,在4 V电压下萃取7 min,HA的清除率达到94%;对于2.5 mg mL-1的HA溶液,以含5%甲基三辛基氯化铵的正辛醇为SLM,在10 V电压下萃取10min,HA清除率达到85%。虽然EME过程中使用的膜溶剂正辛醇对PCR有抑制作用,但是考虑到其溶解度较小,因此在实际应用中不会对PCR产生影响;在EME清除HA后的效果评估方面,对于含0.2 mg mL-1 HA的DNA溶液,经EME处理后的样本对qPCR几乎没有抑制,且DNA保留率为75%;对于含0.6~2.5 mg mL-1 HA的DNA溶液,在EME处理后,可以获得完整的STR基因分型。通过比较发现,EME的纯化能力明显高于苯酚-氯仿法和TIANampMicro DNA Kit;对于富含HA的血液等复杂基质样本,EME展示了超强的净化能力。EME与现有技术联用可以从富含HA的血液样本中获得完整的STR分型图谱或改善的qPCR检测信号。结论:在10 min内,EME可以清除样本中大部分的HA,且EME的清除能力优于现有技术。如将EME技术与现有技术结合将有助于从富含HA的法医样本中获得更加完整、准确的遗传信息。第三部分基于电膜萃取技术探究药品/食品微生物检测中钙离子抑制剂的去除目的:钙在葡萄糖酸钙口服溶液、虾皮等药品/食品样本中含量丰富,可能导致基于PCR技术的微生物检测失败。本章节主要探究EME清除Ca2+进而减轻PCR抑制的可行性。同样包含三个目的:（1）基于EME技术建立去除Ca2+的实验方法;（2）利用qPCR技术评估EME技术去除Ca2+的效果;和（3）验证EME技术去除Ca2+在药品/食品微生物检测中的应用价值。方法:首先从萃取装置、自由液膜（Free liquid membrane,FLM）成分、接收相成分、萃取电压等方面对EME技术的实验条件进行优化;同时考虑FLM成分对PCR的抑制作用;然后使用qPCR评估EME处理葡萄糖酸钙口服溶液或虾皮样本后剩余Ca2+对PCR的影响以及EME过程中金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus,S.aureus）的保留情况;最后,定性检测口服液或虾皮中的S.aureus以验证EME技术在药品/食品微生物检测中的应用价值。结果:对于Ca2+的去除,适合使用微管电膜萃取（Micro-EME,μ-EME）装置,且5相的μ-EME比3相的μ-EME提供更高的清除率;以草酸溶液作为接收相1,以含有5%DEHP的正戊醇作为FLM 1,在150 V电压下运行EME 15 min,可以从葡萄糖酸钙口服溶液中去除63%的Ca2+;虽然膜溶剂正戊醇对PCR有抑制作用,但是在综合考虑其溶解度后,我们认为在实际应用中正戊醇不会对PCR产生影响;在对含S.aureus的葡萄糖酸钙口服溶液进行EME处理后,显著减轻了对PCR的抑制,但是S.aureus在EME过程中的损失较大;在对含S.aureus的虾皮样本进行EME处理后,改善了qPCR信号,避免了假阴性结果的出现。结论:利用EME技术去除Ca2+抑制剂以减轻PCR抑制的概念得到了证实,尽管这种一步式快速前处理方法的灵敏度仍有待进一步提高,但该方法在药品/食品微生物快检中具有较大的应用潜力。