论文部分内容阅读
哺乳动物大脑皮层发育是神经系统结构与功能建成的关键性进程,需要一系列复杂的生物学事件协调配合完成,包括神经前体细胞分裂、分化形成神经元、神经元迁移、成熟、形成突触连接、皮层组织结构形成等。其中神经元能否迁移到皮层正确位置,是大脑皮层正常发育的关键之一,整个进程需要多条信号通路及相关分子协作调节,其中Reelin信号通路在大脑发育期间的神经元辐射迁移和皮层IV层层状结构形成等进程中发挥重要功能。Reelin是一种多功能的细胞外分泌蛋白,可与神经元细胞膜上的受体-极低密度脂蛋白受体和载脂蛋白E受体2结合,磷酸化胞内接头/支架蛋白Disable-1(Dab1)使其活化,活化后的Dab1可招募下游信号分子-Crk/CrkL-C3G-Rap1,参与调节皮层神经元迁移等皮层发育进程。Tks4(Tyrosine kinase substrate with four SH3 domains)是FTHS综合征(Frank-Ter Haar syndrome)关键致病基因SH3PXD2B的蛋白产物,具有1个PX结构域、4个SH3结构域。目前研究表明Tks4在脂肪组织分化、细胞中活性氧物质产生、伪足形成、肌动蛋白细胞骨架重塑中发挥作用,接受胞外信号如EGF(Epidermal growth factor)刺激后,Tks4可参与调节细胞骨架重塑进而影响细胞迁移。同时针对FTHS患者的研究发现,部分患者表现出不同程度的智力缺陷,并伴有脑部发育形态异常等神经系统相关疾病,本实验室前期工作表明Tks4在鼠脑胚胎发育过程中有比较丰富的表达,尤其在E15-E18表达最为显著,胚胎后期表达逐渐减弱。我们首先通过质谱检测技术分析细胞内与Tks4相互作用的蛋白,我们共获得与Tks4相互作用的蛋白484种,主要包括细胞骨架相关蛋白、细胞粘附蛋白、胞外基质蛋白等,涉及信号通路46个,包括EGFR、Notch、PI3K信号通路等。已有文献报道Tks4与Reelin信号通路组分Crk/CrkL存在相互作用,我们体外培养E16.5天的神经元,慢病毒侵染沉默Tks4后,加入Reelin蛋白活化Reelin信号通路,结果显示Tks4沉默后Crk/CrkL下游分子-C3G磷酸化减弱,表明Tks4可能参与到Reelin信号通路中,初步推测Tks4一方面结合Crk/CrkL,另一方面在Reelin的刺激下通过PX结构域结合膜上PI3K产物转运到细胞膜上,完成磷酸化的Dab1对Crk/CrkL-C3G-Rap1的招募过程。为进一步探索Tks4在神经系统中的功能,我们采用子宫内电穿孔技术在E15.5天的鼠脑中沉默Tks4,E18.5天剥离鼠脑,切片染色后发现,Tks4沉默显著抑制皮层神经元的正常迁移,大量神经元阻滞在中间区(intermediated zone,IZ),只有少数神经元可迁移至皮层板(cortical plate,CP),说明Tks4在大脑皮层神经元迁移进程中发挥作用,此外,对脑片进行放大拍摄后发现,小鼠皮层IZ区的神经元形态转换在Tks4沉默后发生改变,与对照组相比,Tks4沉默后IZ上层多极形态神经元增多而双极形态神经元减少,进一步说明Tks4在皮层神经元迁移进程中具有重要作用。至此,我们的研究揭示了Tks4在细胞中与Reelin相关蛋白相互作用,涉及数条重要信号通路,并且可能通过结合Crk/CrkL参与Reelin信号通路,同时在皮层神经元迁移进程中发挥重要作用。