番鸭呼肠孤病毒感染（Muscovy duck reovirus infection）是由番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）引起的一种针对番鸭而引起番鸭免疫系统产生抑制性疾病，因雏番鸭抵抗力弱故对雏番鸭影响重大，是以对番鸭相关的养殖产业经济与效益带来巨大冲击。禽正呼肠孤病毒内核衣壳重要蛋白是 σA 蛋白，其在禽呼肠孤病毒（ARV）和MDRV两者中的编码基因片段不同，前者是由S1基因编码，后者则是由S2基因编码，二者核苷酸同源性仅77%。已有相关文献报道，ARVσA蛋白本身不含核输入序列（NLS）依然具备诱导病毒定位于宿主细胞核质中，其机制是运用核孔复合体（NPC）依赖协助扩散方式。本实验室前期研究发现MDRVσA蛋白也具有入核功能，但其入核机制尚未探究，故而本试验在明确 MDRV σA 蛋白在Vero细胞和DF-1细胞定位情况的基础上，进一步验证突变该蛋白两个关键性氨基酸位点以及在不同条件处理下对σA蛋白亚细胞定位功能的影响，明晰σA蛋白亚细胞定位的机制。
　　1 MDRVσA蛋白亚细胞定位功能的探究
　　本试验利用绿色荧光载体的特性，首先将σA基因插入绿色荧光载体pEGFP-N1中，经过菌液验证、酶切以及测序等方法鉴定，成功构建携带绿色荧光的重组质粒 pEGFP-N1-σA，随后将融合绿色荧光的重组质粒pEGFP-N1-σA分别转染Vero细胞和DF-1细胞后，采用Western Blot技术检测σA基因在细胞中表达以及通过荧光共聚焦显微镜追踪σA定位情况。Western Blot结果显示：pEGFP-N1-σA融合蛋白在Vero细胞和DF-1细胞中均可表达，能被σA多克隆抗体特异性识别，其大小为 73.2kDa，与预期相符；荧光共聚焦结果显示， pEGFP-N1-σA 在不同细胞系中成功表达，并跟踪到绿色荧光信号不仅在细胞质中表达，在细胞核中也有表达，证实了MDRV-YB-σA蛋白具有定位细胞核的功能。
　　2突变关键性氨基酸位点对MDRVσA蛋白入核功能影响的探究
　　本试验以先前本实验室成功构建并保存的 A155R、A273R 和双突变体A155R+A273R三种σA关键性氨基酸位点突变体质粒为模板，运用特异性引物扩增得到三种突变体基因片段，并将之与荧光载体pEGFP-N1 连接构建融合表达质粒，重组质粒分别命名为：pEGFP-N1-σA（A155R）、pEGFP-N1-σA（A273R）以及pEGFP-N1-σA （A155R+A273R）。构建成功后将三种重组质粒转染至DF-1、Vero两种细胞系中，运用荧光共聚焦显微镜追踪融合σA突变体蛋白动态分布情况，并通过核质分离及 Western Blot 方法加以佐证。Western Blot 结果显示：pEGFP-N1-σA 突变体融合蛋白在两种细胞系中均可表达，融合蛋白大小约为73kDa；荧光共聚焦结果显示：融合表达三种突变体蛋白的绿色荧光只分布在细胞质上；核质分离检测结果进一步证实了突变体蛋白只在细胞质中表达，丧失了迁移细胞核的功能。
　　3 MDRV σA蛋白的一种非依赖于核定位信号（NLS）的入核途径探究
　　通过上述研究发现该蛋白能够定位于细胞核中，但已有显示MDRVσA蛋白本身并不具有核定位序列，初步推测该蛋白通过被动运输方式进入细胞核内的可能性很大。被动运输分为两种方式即被动扩散与协助扩散两种运输方式，协助扩散的前提条件是需要借助核孔复合体（NPC）的运载作用且在4℃时该运输方式会被抑制，而被动扩散在4℃时能够自由进入核内且无需核孔复合体的参与。本研究选用能抑制NPC功能的抑制剂-麦胚凝集素（WGA）预先处理Vero细胞和DF-1细胞，再转染重组质粒pEGFP-N1-σA，验证MDRVσA蛋白入核途径是否与NPC有关。结果发现，当WGA浓度为0.5 mol/mL时，重组质粒pEGFP-N1-σA仅仅聚集在细胞质，细胞核中并未出现绿色荧光，核质分离检测也进一步验证出相同结果。可推测，MDRVσA 蛋白进入细胞核与细胞核膜上的 NPC 有关。接着将原本 37℃培养温度降至4℃，结果显示，当处于4℃的温度环境下σA蛋白大量的聚集在细胞质中，而细胞核内并未出现，核质分离结果也得出相同结果。上述结果初步表明，MDRVσA蛋白的入核是通过借助一种核孔复合体的协助扩散方式进入宿主细胞核内，进一步完善 MDRV 的致病机理提供基础的理论依据。