研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)属于中医学“痹证”范畴,是中医临床辨证论治的优势病种。对RA进行辨证分型是确定相应治疗原则和方法的前提,体现了中医诊疗RA辨证论治和整体观的理论特色与优势。虚、实证候作为八纲辨证的基本证候类型,是RA辨证论治所必须辨明的诊断要素之一。长期以来,中医证候分类研究缺乏客观量化标准,如何运用现代科学方法揭示中医证候理论蕴藏的科学内涵,探索中医证候分类的生物学基础,阐明中医辨证论治的微观机制,显得极为重要。肝肾亏虚证和寒湿痹阻证是RA虚、实证候分类中的主要证候代表类型之一,选取其作为切入点进行RA虚、实证候的初步探索,有助于为将来更全面、系统开展中医证候分类研究提供可靠的科学依据和技术理论支撑,从而促进中医学证候理论的传承和发展,进而指导RA临床更精准的辨证论治,获得更优的临床疗效。目的:本研究旨在通过文本挖掘技术,结合生物信息学分析对RA虚实证候的生物学特征进行探索;同时,对临床收集的RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证患者血清样本进行代谢组学研究,获得代谢水平的RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证生物学特征,并与RA虚实证候的文本挖掘结果进行对比验证,从而获得RA虚实证候潜在的生物学基础证据。方法:1.RA虚实证候文本挖掘研究:运用文本挖掘技术,基于PubMed、SinoMed数据库,以“关节炎,类风湿”、“类风湿关节炎”、“类风湿性关节炎”、“Rheumatoid Arthritis”、“Arthritis,Rheumatoid”和“虚证”、“实证”、“Deficiency syndrome”、“Deficiency pattern”、“Xu Zheng”、“Excess syndrome”、“Excesspattern”、“Shi Zheng”等主题词和自由词进行文本检索。经过数据清洗、处理、可视化,并结合可以通过建模分析、理解复杂生命系统的Ingenuity pathway analysis(IPA)软件,得到RA虚实证候的生物学特征。2.RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证代谢组学研究:(1)按照制定的RA诊断标准、中医证候诊断标准、纳入标准、排除标准进行临床研究对象的纳入和血清样本的收集、保存。(2)对血清样本进行预处理,并运用UPLC-QTOF-MS技术进行代谢组学检测,将获得的原始数据进行处理后,进行多元统计分析和差异代谢物的鉴定,并结合IPA进行生物信息学分析,获得代谢水平的RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证生物学特征,进一步与RA虚实证候的文本挖掘结果进行对比验证。结果:1.通过对RA虚实证候的文本挖掘研究,在PubMed和SinoMed数据库获得633篇RA虚证检索结果和208篇RA实证检索结果(信息截止到2019年12月31日)。通过对RA虚实证候文本挖掘相关生物分子一维结果进行对比,显示RA虚证相关生物分子与RA实证相关生物分子相比整体较多,虚证相关生物分子频次大于30的有14个:IgG(184 次),Nitric Oxide(130 次),CD4(118 次),Glut1(67 次),IgE(57 次),CD18(56 次),Dopamine(48 次),SOD(46 次),Testosterone(44 次),IL-2(43次),IgM(38 次),5-hydroxytryptamine(37 次),Cholesterol(31 次),INF-γ(31次);而实证相关生物分子频次大于30的仅2个:Nitric Oxide(59次),Mineralocorticoid(31次)。在排名前15的生物分子中,虚实证共有4个相同的生物分子:IgG,Nitric Oxide,IgE,CRP。文本挖掘分别提取到RA虚证416项相关生物分子组合,RA实证276项相关生物分子组合。虚证中IgG与IgM的关联最紧密,其次为CD4与CD8,CD18与 Leukocytes。实证中 Mineralocorticoid 与 Hydroxysteroid dehydrogenases 的关联最密切,其次为 Renin 与 Aldosterone,Hydrocortisone 与 Aldosterone。2.经过IPA分析,获得RA虚证相关生物分子特有的生物通路(排名前5)分别是:真核生物的错配修复(Mismatch Repair in Eukaryotes),卵巢癌信号(Ovarian Cancer Signaling),调节上皮-间质转化途径(Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition Pathway),胰腺癌信号(Pancreatic Adenocarcinoma Signaling)和遗传性乳腺癌信号(Hereditary Breast Cancer Signaling)。获得RA实证相关生物分子特有的生物通路(排名前5)分别是:多能造血干细胞造血作用(Hematopoiesis from Pluripotent Stem Cells),Th1 通路(Th1 Pathway),高迁移率族蛋白 1 信号(HMGB1 Signaling),Thl 和 Th2 的激活途径(Th1 and Th2Activation Pathway)和细胞因子在调节免疫细胞间通讯中的作用(Role of Cytokines in Mediating Communication between Immune Cells)。获得 8 个与 RA虚证相关生物分子密切相关的功能与疾病:代谢性疾病(Metabolic Disease),细胞死亡与存活(Cell Death and Survival),营养性疾病(Nutritional Disease),细胞运动(Cellular Movement),分子转运(Molecular Transport),维生素和矿物质代谢(Vitaminand Mineral Metabolism),遗传障碍(Hereditary Disorder)和心理障碍(Psychological Disorders)。获得8个与RA实证相关生物分子密切相关的功能与疾病:心血管疾病(Cardiovascular Disease),细胞功能与维持(Cellular Functionand Maintenance),发育障碍(Developmental Disorder),细胞生长和增殖(Cellular Growth and Proliferation),神经性疾病(Neurological Disease),蛋白质合成(Protein Synthesis),过敏反应(Hypersensitivity Response)和细胞装配与构架(Cellular Assembly and Organization)。3.本研究共纳入RA肝肾亏虚证女性患者19例,寒湿痹阻证女性患者41例,健康女性30例。通过血清样本的代谢组学研究,获得25个RA肝肾亏虚证差异代谢物和24个RA寒湿痹阻证差异代谢物。在两个证候共同含有的19个差异代谢物中,RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证之间存在统计学差异的有15个,其中:L-同型半胱氨酸(L-Homocysteic acid),磷脂酰乙醇胺(P-16:0/0:0)(LysoPE(P-16:0/0:0)),N(Q)-羟精氨酸(N(omega)-Hydroxyarginine)和溶血磷脂酰胆碱(16:0/0:0)(LysoPC(16:0/0:0))在寒湿痹阻证中下降更加明显;S-亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione),5-胸苷酸(5-Thymidylic acid),SN38-葡萄糖苷酸(SN38 glucuronide),磷脂酰乙醇胺(22:0/24:0))(PE(22:0/24:0)),磷脂酰胆碱(24:0/24:1(15Z))(PC(24:0/24:1(15Z)))和1,4-二焦磷酸肌醇-四磷酸(Bisdiphosphoinositoltetrakisphosphate)在肝肾亏虚证中上升更加明显;丙酮酸(Pyruvic acid),D-核酸糖(D-Ribose),γ-甘油醛(Gamma-Glutamylserine),磷脂酰乙醇胺(22:0/24:1(15Z))(PE(22:0/24:1(15Z)))和肌苷酸(Inosinic acid)在寒湿痹阻证中上升更加明显。RA肝肾亏虚证特有6个差异代谢物:5-甲氧基色胺(5-Methoxytryptamine),4-延胡索酰乙酰乙酸(4-Fumarylacetoacetic acid),溶血磷脂酰胆碱(18:1(9Z)/0:0)(LysoPC(18:1(9Z)/0:0)),溶血磷脂酰胆碱(20:1(11Z)/0:0)(LysoPC(20:1(11Z)/0:0)),葡萄糖神经酰胺(d18:1/12:0)(Glucosylceramide(d18:1/12:0))和磷脂酰乙醇胺(20:3(5Z,8Z,11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))(PE(20:3(5Z,8Z,11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)))。RA寒湿痹阻证特有5个差异代谢物:y-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric acid,GABA),单油基磷脂酸(18:1(9Z)/0:0)(LysoPA(18:1(9Z)/0:0)),甘油二酯(18:3(6Z,9Z,12Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0)(DG(18:3(6Z,9Z,12Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0)),左旋精氨酸(L-Targinine)和磷脂酰胆碱(24:0/24:0)(PC(24:0/24:0))。4.经过IPA分析,获得RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证共有的19个差异代谢物相关生物通路(排名前5):半胱氨酸降解Ⅱ(L-cysteine DegradationⅡ),甘氨酸生物合成Ⅲ(Glycine Biosynthesis Ⅲ),丙氨酸降解 Ⅲ(Alanine DegradationⅢ),丙氨酸生物合成Ⅱ(Alanine Biosynthesis Ⅱ)和 L-丝氨酸降解(L-serine Degradation)。获得与两个证候相关的分子功能与疾病(排名前5):免疫性疾病(Immunological Disease),小分子生化过程(Small Molecule Biochemistry),细胞形态(Cell Morphology),细胞循环(Cell Cycle)和结缔组织疾病(Connective Tissue Disorders)。获得3个RA肝肾亏虚证特有差异代谢物的相关生物通路:褪黑素降解Ⅱ(Melatonin Degradation Ⅱ),酪氨酸降解Ⅰ(Tyrosine DegradationI)和褪黑素降解的超途径(Superpathway of Melatonin Degradation)。获得 6个RA肝肾亏虚证相关分子功能:氨基酸代谢(Amino Acid Metabolism),细胞间的信号和相互作用(Cell-To-Cell Signaling and Interaction),机体损伤和异常(Organismal Injury and Abnormalities),分子转运(Molecular Transport),炎症反应(Inflammatory Response)和核酸代谢(Nucleic Acid Metabolism)。获得5个RA寒湿痹阻证特有差异代谢物相关生物通路:谷氨酸依赖性耐酸(Glutamate Dependent Acid Resistance),4-氨基丁酸降解Ⅰ(4-aminobutyrate Degradation Ⅰ),谷氨酸降解 Ⅲ(通过 4-氨基丁酸)(Glutamate DegradationⅢ(via 4-aminobutyrate)),腐胺降解 Ⅲ(Putrescine Degradation Ⅲ),GABA受体信号(GABAReceptor Signaling)和神经炎症信号通路(Neuroinflammation Signaling Pathway)。获得8个与寒湿痹阻证相关分子功能:细胞生长和增殖(Cellular Growthand Proliferation),DNA 复制、重组和修复(DNA Replication,Recombination,and Repair),能量产生(Energy Production),细胞平衡(Cellular Compromise),细胞发育(Cellular Development),翻译后修饰(Post-Translational Modification),细胞装配与构架(Cellular Assembly and Organization)和自由基清除(Free Radical Scavenging)。5.将代谢组学研究结果与文本挖掘研究结果进行对比,结果显示RA肝肾亏虚证差异代谢物相关分子功能与文本挖掘RA虚证相关的分子功能中,分子转运(Molecular Transport)为两者共有,且RA肝肾亏虚证差异代谢物在该功能中的分子为:5-甲氧基色胺(5-Methoxytryptamine);RA虚证相关生物分子在该功能中的分子为:ADCY、cyclic AMP、hydrogen peroxide、melatonin、BDNF、CCR5、CD4、CD40、CRP、CXCR4、DRD2、DRD4、HTR4、IL2、IL6、ITGB2、JAK2、KCNJ11、PDE5A、SLC2A1、SMAD4、STAT3、TNF、VEGFA、VIP、AR、BAX、ADCY,分子间具有复杂的密切关系。RA寒湿痹阻证差异代谢物相关分子功能与文本挖掘RA实证相关的分子功能中,细胞生长和增殖(Cellular Growth and Proliferation)的分子功能与细胞装配与构架(Cellular Assembly and Organization)功能为两者共有。RA寒湿痹阻证差异代谢物在细胞生长和增殖(Cellular Growth and Proliferation)功能中的分子为:γ-氨基丁酸(GABA)、单油基磷脂酸(18:1(9Z)/0:0)(LysoPA(18:1(9Z)/0:0)/monooleylphosphatidic acid)和左旋精氨酸(L-Targinine/N(G)-monomethyl-D-arginine);RA实证相关生物分子在该功能中的分子为:IL2、IL4、IL6、PLAT、TNF、CD4、CD8A、CRP,分子间具有复杂的密切关系。RA寒湿痹阻证差异代谢物在细胞装配与构架(Cellular Assembly and Organization)功能中的分子为:γ-氨基丁酸(GABA)和左旋精氨酸(L-Targinine/N(G)-monomethyl-D-arginine);RA实证相关生物分子在该功能中的分子为:IL4、IL6、TNF、CRP,分子间具有复杂的密切关系。结论:1.差异代谢物5-甲氧基色胺(5-Methoxytryptamine)介导褪黑素降解Ⅱ(Melatonin DegradationⅡ)和褪黑素降解的超途径(Superpathwayof Melatonin Degradation)生物通路,并参与分子转运(Molecular Transport)是RA女性患者肝肾亏虚证的生物学特征,也是RA虚证潜在的生物学基础;2.差异代谢物γ-氨基丁酸(GABA)介导4-氨基丁酸降解Ⅰ(4-aminobutyrate DegradationI),谷氨酸降解 Ⅲ(通过 4-氨基丁酸)(Glutamate Degradation Ⅲ(via 4-aminobutyrate))和 GABA 受体信号(GABAReceptor Signaling)生物通路,并参与细胞生长和增殖(Cellular Growth and Proliferation)和细胞装配与构架(Cellular Assembly and Organization)是RA女性患者寒湿痹阻证的生物学特征,也是RA实证潜在的生物学基础;3.基于文本挖掘和代谢组学技术,结合生物信息学分析,将RA肝肾亏虚证和寒湿痹阻证代谢水平的生物学特征与RA虚实证候文本挖掘研究结果进行对比验证,可以获得RA虚实证候潜在的生物学基础,为进一步的实验验证提供证据支持,也可以为中医证候,特别是RA虚、实证候分类研究提供方法、技术的借鉴和参考。