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目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)中最常见的亚型,虽然有很多研究致力于探讨DLBCL的分子机制及驱动基因,但人们对此仍然知之甚少。本研究旨在鉴定DLBCL发生发展过程中的关键候选基因,进一步筛选DLBCL的免疫共刺激分子,并阐明筛选出的OX40在DLBCL肿瘤微环境中的表达特征及与患者的预后关系,以期筛选适合OX40靶点激动剂的DLBCL亚群病人,为DLBCL的精准免疫治疗提供理论基础。方法:1.从GEO数据库获取DLBCL组织和正常淋巴组织的基因表达谱芯片数据。使用GEO2R筛选两者之间上调的差异表达基因。使用STRING在线数据库构建差异表达基因的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络。使用Cytoscape的MCODE插件识别PPI网络中最重要的模块。模块中的基因被视为影响DLBCL发生发展的关键候选基因,对其进行GO和KEGG功能富集分析。获取Oncomine数据库中OX40在m RNA表达芯片中的表达数据,各自分析OX40的m RNA表达量在DLBCL组织和正常淋巴组织间的表达差异。获取Oncomine数据库中OX40的m RNA的生存数据进行生存分析。2.采用多重免疫荧光染色对229例DLBCL患者石蜡样本及64例周围正常淋巴组织样本中的以下指标进行了荧光染色:OX40,CD4,CD8,Foxp3,Pax-5,DAPI。采用Mantra组织定量成像系统进行多光谱成像及信号拆分,Inform软件进行图像定量统计分析。3.采用非参数秩和检验比较癌和癌旁OX40的表达差异,以及OX40在三种不同T细胞亚型(包括CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和Treg细胞)肿瘤微环境的表达差异。4.将表达OX40的每种微环境细胞各自的细胞数转化为每平方厘米的相对细胞数,采用中位数将OX40的总表达量分为高表达组和低表达组,肿瘤微环境中OX40~+CD4~+T淋巴细胞、OX40~+CD8~+T淋巴细胞、OX40~+Treg细胞采用同样的方法确定临界值。5.进行生存分析以评价总的OX40的表达高低以及在不同亚型T细胞上的表达高低对患者预后的影响。采用多因素Cox比例风险回归模型来评估各项预后因素。结果:1.筛选获得DLBCL组织中598个重叠的上调差异基因。分析获得差异表达基因中最重要的四个模块,其中涉及到142个关键候选基因。这些关键候选基因主要富集于PI3K-Akt、局灶性粘连、ECM-受体相互作用和细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。进一步筛选获得关键候选基因中涉及到免疫共刺激信号的分子OX40作为研究目的基因。2.分析显示,OX40在DLBCL组织中的m RNA表达量显著高于正常的淋巴组织(cluster 1,p=0.015;cluster 2,p<0.001)。分析显示,OX40的m RNA表达水平越高,DLBCL患者的预后越好(p=0.018)。3.我们分析了64对成对的DLBCL组织和周围正常淋巴组织中OX40的表达情况,发现肿瘤组织中OX40+的细胞数量明显高于周围正常淋巴组织(p=0.029)。OX40的总表达量高低与Ann Arbor分期(p=0.039)和IPI评分(p=0.047)显著相关,患者分期越晚、IPI评分越高,OX40的表达量越低。在121例接受了R-CHOP-like治疗并进行了疗效评价的患者中,CR与PR患者OX40的表达量没有显著差异,但是与SD/PD患者相比,二者OX40的表达量均明显升高(p=0.002;p=0.002)。在整个队列中,总OX40高表达组患者和低表达组患者的平均生存时间分别为87.9个月(95%CI:79.3-96.4)和66.8个月(95%CI:57.9-75.6),平均复发时间分别为78.0个月(95%CI:68.6-87.3)和55.7个月(95%CI:48.7-66.7)。与低表达组患者相比,高表达组患者的OS(p=0.008)和PFS(p=0.010)均显著延长。当在接受R-CHOP-like治疗的患者中进行比较时,这种差异仍然很显著(p=0.020;p=0.021)。4.在229例DLBCL组织中,OX40在CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和Treg细胞上表达的细胞密度分别为2160/cm~2、279/cm~2和111/cm~2(p<0.001),表达的阳性率分别为16.67%、0.98%和44.75%(p<0.001),可见OX40尽管主要表达在CD4~+T细胞表面,并且以Treg细胞为主,但是表达OX40的CD8~+T细胞密度却显著高于表达OX40的Treg细胞密度。5.在整个队列中,OX40~+CD4~+T细胞表达高低对患者的OS(p=0.114)和PFS(p=0.367)都没有显著差异。当在接受R-CHOP-like治疗的患者中进行比较时,与低表达组患者相比,高表达组患者的OS(p=0.021)明显延长,但对PFS(p=0.093)依然没有显著影响。在整个队列中,OX40~+CD8~+T细胞高表达组患者和低表达组患者的平均生存时间分别为88.8个月(95%CI:80.4-97.2)和66.0个月(95%CI:57.1-74.8),平均复发时间分别为77.0个月(95%CI:67.6-86.4)和58.8个月(95%CI:49.8-67.8)。与低表达组患者相比,高表达组患者的OS(p=0.004)和PFS(p=0.028)均显著延长。当在接受R-CHOP-like治疗的患者中进行比较时,这种差异仍然很显著(p=0.009;p=0.045)。无论在整个队列中,还是在接受R-CHOP-like治疗的患者中,OX40~+Treg细胞表达高低对患者的OS(p=0.283;p=0.530)和PFS(p=0.201;p=0.534)都没有显著差异。6.多因素分析显示,OX40~+CD8~+T细胞表达量是DLBCL患者独立的预后因素。结论:通过GEO数据库筛选并鉴定出影响DLBCL发生发展的关键候选基因142个,这些关键基因涉及多条癌基因信号通路。深入筛选获得涉及到免疫共刺激信号的分子OX40作为本研究目的基因。进一步发现OX40在DLBCL组织中的m RNA表达量显著高于正常的淋巴组织,且表达水平越高,患者预后越好。我们的研究发现,OX40在DLBCL组织中的表达显著高于周围正常淋巴组织;OX40表达与患者Ann Arbor分期和IPI评分等临床病理特征显著相关;肿瘤组织中OX40主要表达于CD4~+T细胞,尤其是Treg细胞;OX40总表达高的患者无论OS还是PFS皆显著延长。肿瘤微环境分析发现,OX40在CD8~+T细胞上表达显著影响患者预后,且表达越高,预后越好;但在Treg细胞上表达尚未观察到显著差异。多因素分析发现,OX40~+CD8~+T细胞表达量是DLBCL患者独立的预后因素。