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研究背景与目的葡萄膜炎是世界范围内的一种常见眼部炎症性疾病。葡萄膜炎又称色素膜炎,是虹膜、睫状体及脉络膜组织炎症的总称,广义上的葡萄膜炎包括整个眼球的炎症。根据发病原因进行分类,葡萄膜炎分为感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎。非感染性葡萄膜炎是最主要葡萄膜炎类型,在我国占比高达55%。其发病原因与遗传与环境交互作用引起机体自身免疫紊乱有关,特别是人体临床研究发现,患葡萄膜炎的母亲其所生孩子在一定年龄时也会患上葡萄膜炎,提示母亲的葡萄膜炎疾病可以遗传给她的后代。自身免疫性疾病炎症性肠炎人体临床调查研究发现,同时患此病的父母所生的孩子其发生炎症性肠炎的机率较患有此病的单亲所生的孩子高,提示父母同时患有自身免疫性疾病对子女患病的机率影响更大。非感染性葡萄膜炎作为一种多器官参与的自身免疫性疾病,其父母所患的葡萄膜炎是否能影响到其后代以及如何影响尚未见报道。实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveoretinitis,EAU）是一种由视网膜抗原诱导易感动物所引起T细胞介导的自身免疫性疾病,是模拟人类非感染性葡萄膜炎的疾病动物模型,广泛地被应用于人类葡萄膜炎的发病原因、发生机制及其防治研究。常用EAU模型动物主要有大鼠、小鼠、树鼩等,小鼠EAU则包括B10RIII小鼠和C57BL/6近交系,其中B10RIII小鼠为葡萄膜炎最易感动物,而C57BL/6小鼠则仅为中度易感。而且B10RIII小鼠诱导的EAU在病理表现和免疫发病机制等方面与人类葡萄膜炎的特点很相似,是目前应用最多的经典EAU模型。基于上述的研究背景,我们应用光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP161-180)抗原多肽免疫B10RIII成年雌雄小鼠,免疫后当天将雌雄小鼠合笼交配繁殖,大体观察评价亲本葡萄膜炎对子代小鼠组织器官发育的影响;选择上述受影响子代小鼠的皮肤、眼组织以及脾脏,进行病理组织学切片或提取RNA,利用苏木素伊红染色（H&E）技术和转录组测序（RNA-Seq）技术评价双亲葡萄膜炎对受影响组织病理形态学的影响,筛选葡萄膜炎影响子代小鼠的基因功能富集的生物过程、代谢途径以及信号通路。最后,我们通过IRBP161-180抗原免疫受葡萄膜炎影响的子代小鼠,评价亲代葡萄膜炎是否影响子代鼠对葡萄膜炎的易感性及其影响机制。第一部分亲代EAU对子代生长发育及其受影响组织差异基因表达谱的影响方法为诱导双亲葡萄膜炎,使用经典的免疫诱导方法对成年雌雄B10RIII小鼠进行免疫:将包含50μg的IRBP161-180肽段PBS溶液与完全弗氏佐剂（CFA）按照1:1比例乳化,分别给予小鼠左右大腿各50μl,尾背部100μl共计200μl进行皮下注射免疫。通过眼科眼底镜观察被免疫后亲代小鼠的葡萄膜炎发生及进展规律。免疫后当天按照2雄3雌的比例进行合笼允许交配繁殖,第二天早上开始检查雌性是否出现阴栓,以出现阴栓作为孕期第一天。隔天大体观察子代新生小鼠的被毛、睁眼等发育变化情况,评价亲本葡萄膜炎对子代小鼠的生长发育的影响。在子代小鼠出生后29天,选取观察到异常外观的3只子代小鼠,取其异常外观的皮肤,眼睛和脾脏组织,进行病理组织学切片和提取RNA后进行转录组RNA测序（RNA-seq）,评价双亲患葡萄膜炎对子代鼠上述受影响组织的基因表达谱的影响,筛选亲代葡萄膜炎影响子代鼠皮肤、眼组织以及脾脏的差异基因,以及差异基因功能富集的生物过程、代谢途径以及信号通路;利用实时荧光定量q-PCR技术对转录组测序筛选出的差异基因进行验证。在上述实验中,同时设置未进行抗原免疫的B10RIII小鼠亲代所生的同日龄正常小鼠作为正常对照组进行实验。结果通过眼底镜观察实验组的亲代小鼠均成功建立了EAU模型,亲代小鼠在免疫后第7天或8天开始出现炎症表现,第14天炎症到达高峰,表现出瞳孔缺损,虹膜充血和角膜混浊,随后炎症逐渐降低,第21天时降至一个较低的水平。因此,将亲代在免疫后7天到20天炎症活动期间受孕所生的新生小鼠作为F1子小鼠,而将亲代在免疫后21天炎症转归期间受孕所生的新生小鼠作为F2子小鼠。通过大体观察发现,炎症活动期受孕所生的F1子小鼠在出生后第14天出现毛发掉落,持续维持到出生后39天,同时发现小鼠睁眼延迟,在出生后29天取材时观察到脾脏明显肿大,而炎症静止期受孕所生的F2子小鼠和健康对照组小鼠未观察到明显的毛发异常现象。皮肤组织RNA未达到RNA-seq测序质量标准而排除于后续测序实验。RNA-seq测序结果显示,实验组与对照组脾脏和眼组织的聚类显示不同组织的组间样本相关系数较低,而同种组织相同组别样品的相关系数高;差异基因分析发现,眼组织共有393个差异基因,其中上调基因363个,下调基因30个。主要差异基因基因本体论GO归类富集于586个生物过程,111个细胞组分,110个分子功能,排名前3位的GO归类依次为免疫系统过程、肌肉系统过程和细胞骨架蛋白连接;免疫系统过程中最相关的为免疫反应、外部刺激反应、髓系细胞反应、抗原处理与提呈、T细胞激活、免疫效应过程;更有趣地是,效应性Th17细胞转录因子维甲酸孤儿受体-α（RORα）在受影响的后代中表达明显增加。脾脏组织与眼组织GO归类共同富集于免疫系统过程、免疫反应、固有免疫反应、外部刺激反应、多细胞生物突的调节、发育过程等。q-PCR结果显示,实验组和对照组眼组织中的8个差异基因表达模式与对应的RNA-Seq测序结果一致,提示RNA-Seq测序结果的准确性。结论使用IRBP161-180抗原免疫诱导B10RIII小鼠成功建立EAU后繁殖,亲代EAU会导致炎症活动期受孕的子代小鼠的毛发脱落、睁眼延迟和脾脏肿大,且这些异常与毛囊发育和分化相关基因、眼肌活动相关基因以及免疫相关等基因的异常表达相关。最重要地是,脾脏组织和眼组织差异基因GO归类最显著地共同富集于免疫系统过程,提示双亲葡萄膜炎最显著地影响炎症期受孕的子代免疫系统过程。第二部分亲代葡萄膜炎对子代患葡萄膜炎易感性的影响方法由上研究可知,亲代葡萄膜炎显著地影响了子代小鼠的免疫系统过程。那么,这些受亲代葡萄膜炎影响的免疫系统过程是否能进一步影响子代对自身免疫性葡萄膜炎的易感性尚待进一步研究。因此,为进一步评价亲代葡萄膜炎对子代患葡萄膜炎易感性的影响,取EAU双亲在炎症活动期受孕的F1子代小鼠和双亲炎症消退期受孕的F2小鼠,分别将包含50μg、25μg和5μg IRBP161-180肽段和CFA的乳化物200μl皮下注射免疫诱导F1子代小鼠和F2子代小鼠EAU。同时设立上述三种剂量诱导来源于未免疫抗原肽亲代的健康子代小鼠EAU对照。免疫后第7天,14天,21天,35天通过裂隙灯显微照像系统和眼底镜观察眼前段和眼底炎症发生发展演进过程和临床评分;在免疫后14天和35天分别取小鼠眼球进行HE染色观察评价眼组织发生炎症组织病理改变和病理组织学评分;子代鼠免疫后14天和35天,取脾脏和外周淋巴结通过尼龙羊毛柱法分离获得抗原提呈细胞和T淋巴细胞,通过MTT细胞增殖试剂盒检测亲代葡萄膜炎对子代EAU鼠中抗原提呈细胞刺激IRBP抗原特异的T淋巴细胞增殖反应的影响;最后在子代鼠免疫后35天,取脾脏和外周淋巴结通过尼龙羊毛柱法分离获得抗原提提呈细胞和T淋巴细胞,ELISA法评价将双亲葡萄膜炎对子代EAU小鼠中抗原提呈细胞刺激IRBP抗原特异的T淋巴细胞产生炎性细胞因子IL-17的影响。结果低剂量5μg IRBP161-180抗原肽和中剂量25μg IRBP161-180抗原肽诱导F1子代组和F2子代组在免疫后第8天发生炎症,在14天到达炎症高峰,而后炎症严重程度逐渐降低,维持至中度的炎症水平;眼前端临床表现主要为角膜浑浊、结膜和或睫状充血、前房积脓、瞳孔不规则和缺损等;眼底观察可见视盘炎症、血管炎、视网膜组织炎症以及严重地视网膜结构破坏;组织病理学改变主要表现为视网膜和脉络膜炎性细胞广泛浸润、视网膜结构折叠紊乱、视网膜内可见肉芽肿形成,视网膜下腔广泛纤维素的渗出。低剂量5μg IRBP161-180肽诱导正常子代小鼠未观察到发生EAU,中剂量25μg IRBP161-180抗原肽诱导正常子代小鼠于在免疫后第11或12天出现炎症,随后炎症严重程度逐渐上升至中等水平,在28天时达到高峰,而后炎症减退至低水平。与正常对照子代小鼠EAU比较,低剂量5μg IRBP161-180肽诱导F1子代EAU组临床评分显著性增加（P=0.0025）。在病理组织评分方面,低剂量5μg诱导的EAU与临床评分呈现相似的规律（P=0.0041）。而在高剂量组50μg IRBP161-180肽诱导的EAU中,F1子小鼠组与对照子小鼠EAU在免疫后第8天出现炎症,其进展规律、临床表现和病理组织学特征相似,炎症临床评分和病理组织学评分无显著性差异（P>0.05）。MTT检测淋巴细胞增殖实验结果显示,与正常后代小鼠EAU对照组比较,10μg IRBP161-180和20μg IRBP161-180抗原都明显诱导低剂量、中剂量和高剂量抗原F1小鼠EAU诱导组中淋巴细胞增殖(P=0.0024,P=0.0019,P=0.039,依次为10μg IRBP161-180抗原刺激低剂量、中剂量和高剂量组;P=5.79e-6,P=0.0041,P=0.011,依次为20μg IRBP161-180抗原刺激低剂量、中剂量和高剂量组);ELISA检测细胞上清结果显示,与正常子代小鼠EAU对照组比较,5μg和25μg免疫诱导F1小鼠EAU中10μg IRBP161-180（P=0.0018,P=0.000059;分别对应于5μg和25μg诱导EAU组）和20μg IRBP161-180（P=0.0021,P=0.0033;分别对应于5μg和25μg诱导EAU组）刺激T淋巴细胞明显增加的效应性Th17细胞特异性炎性细胞因子IL-17的产生。5μg和25μg免疫诱导F2小鼠EAU中10μg和20μgIRBP161-180并不显著性刺激T淋巴细胞产生IL-17（P>0.05）。结论双亲葡萄膜炎同时增加活动性炎症和消退期炎症两种炎症状态下受孕的子鼠对葡萄膜炎的易感性,但活动性炎症受孕子代鼠在低剂量抗原暴露诱导的EAU炎症程度更高。且这种易感性可能与双亲葡萄膜炎诱导了子代T淋巴细胞增殖和炎性细胞因子IL-17异常增加有关。