寻常痤疮患者AR、IGF1R基因甲基化检测

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:reddhong
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背景:寻常痤疮是一种毛囊皮脂腺单位的炎症性疾病,发病机制涉及雄激素代谢、皮脂分泌、嗜脂性微生物感染、免疫-炎症反应。已证明雄激素受体(AR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)在寻常痤疮中异常表达,参与了寻常痤疮的发病机制,但对其异常表达的机制尚不明确。DNA甲基化调控基因表达,调节脂代谢和炎症反应。本课题组前期采用基因甲基化芯片技术筛选,发现寻常痤疮患者存在AR基因和IGF1R基因差异甲基化,但甲基化位点及甲基化水平需要进一步研究。目的:明确寻常痤疮患者AR基因、IGF1R基因甲基化位点及甲基化水平,初步阐明AR基因、IGF1R基因甲基化与寻常痤疮的关联。方法:1.标本收集:征得南方医科大学深圳医院伦理委员会同意。制定入选标准,选取南方医科大学深圳医院门诊就诊、有家族史的中重度寻常痤疮患者,常规抽取外周全血(痤疮血液组,CCXY),粉刺针收集全部白头粉刺及黑头粉刺组织(痤疮组织组,CCZZ);正常对照组外周血(正常血液组,ZZXY)及其皮损组织(正常组织组,ZCZZ)均来自南方医科大学深圳医院皮肤科门诊行背部色素痣切除患者(年龄、性别与患者组相匹配,排除系统性疾病及其他皮肤病)。所有参与本研究的患者签署书面知情同意书。2.DNA提取及质量检测:使用DNA提取试剂盒提取外周血样本及皮肤组织全基因组DNA。使用紫外分光光度仪检测DNA浓度及纯度,1.5%琼脂凝胶电泳检测DNA完整性,OD260/OD280比值在1.7~2.1之间,且条带清晰完整,为合格DNA。保存于-80℃冰箱中备用。3.CpG位点筛选:通过Gene CpG v1.0软件对AR基因、IGF1R基因CpG位点的进行筛选。4.重亚硫酸盐处理:DNA样本经EZ DNA Methylation-Gold?Ki重亚硫酸盐转换试剂盒处理后,使得未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。亚硫酸氢盐处理和随后的PCR扩增所需的人类基因组DNA的最小量500pg。5.引物设计和优化:利用geneCpG软件对分别对AR、IGF1R基因组区域进行分析,并将其转化为双稳态DNA序列。使用来自bisulfite-convert DNA的primer3软件(http://primer3.ut.ee/)设计PCR引物;基于毛细管电泳的特殊方法,优化多重PCR panel中的引物组成及浓度。6.样本目标片段多重PCR反应:使用优化后的多重PCR引物panel,以转化后的样品基因组为模板,进行多重PCR扩增。7.样本添加特异性标签序列:利用带有Index序列的引物,通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。8.定量文库及上机测序:样品切胶回收后获得最终的MethylTarget测序文库,Agilent 2100 Bioanalyzer验证文库的片段长度分布。精确文库摩尔浓度后,最终于Illumina Hiseq平台通过进行高通量测序,获得FastQ数据。结果:1.共收集到深圳地区汉族寻常痤疮患者20例,其中男性7例(35%),女性13例(65%),平均年龄(25.50±1.70)岁;正常对照组20例,其中男性4例(20%),女性16例(80%),平均年龄(23.90±2.94)岁。2.质检合格的DNA:CCZZ 13例,CCXY 18例,ZCZZ 9例,ZZXY 19例。AR基因包含3个CpG岛,包含40个CpG位点;IGF1R基因包含6个CpG岛,135个CpG位点。3.痤疮组与正常对照组对比后发现AR基因有37个CpG位点的平均甲基化水平增高,且均存在于痤疮组织组中;IGF1R基因中有51个CpG位点的平均甲基化水平增高,3个CpG位点的平均甲基化水平降低。4.痤疮组与正常对照组对比后发现共有7个基因区域存在甲基化差异,且均存在于痤疮组织组中,其中AR基因的3个CpG岛区域的平均甲基化水平增高,IGF1R基因的4个CpG岛区域的平均甲基化水平降低。5.痤疮组织组与正常对照组对比后发现AR基因存在甲基化差异,且AR基因的平均甲基化水平增高。痤疮组织组与正常血液组对比后发现IGF1R基因存在甲基化差异,且IGF1R基因的平均甲基化水平降低。结论:1.寻常痤疮患者中存在AR基因和IGF1R基因甲基化异常;2.寻常痤疮患者皮损组织中AR基因呈高度甲基化状态,IGF1R基因呈低甲基化状态;3.痤疮患者外周血中AR基因及IGF1R基因与正常对照组对比后平均甲基化水平无差异;4.AR基因高甲基化状态和/或IGF1R基因低甲基化状态可能通过调控相应基因的表达,参与寻常痤疮的发病,但确切机制需要进一步研究阐明。
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