藻红蛋白制备荧光标记物的基础与应用研究

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本研究以蛋白质含量丰富的红毛藻为原材料,采用硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析相结合,快速高效地分离纯化R-藻红蛋白,并将该蛋白与抗体等交联制备荧光标记物,研究其在免疫检测领域的应用。本实验采用pH值线性梯度和盐浓度线性梯度相结合的混合梯度方式对吸附于DEAE-Sepharose阴离子交换柱的蛋白进行洗脱,从而分离纯化到纯度(A565/A280)大于6.0藻红蛋白。根据其可见光光谱学特征判断藻红蛋白属于R-藻红蛋白,荧光发射峰位于572nm左右。SDS-PAGE结果显示,其亚基分子量分别为19和21 kDa。Native-PAGE结果表明,纯化效果良好。采用转谷氨酰胺酶(TGase)交联R-藻红蛋白与亲和素(Avidin),SDS-PAGE和荧光检测结果显示,R-藻红蛋白与亲和素成功交联,且R-藻红蛋白与亲和素的质量浓度比为1:10时,两者交联效率最高。荧光标记物的免疫检测结果表明,R-藻红蛋白标记的亲和素能检测生物素及生物素标记的抗体的存在,且荧光强度大。采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶基二硫丙酸醇(SPDP)交联兔抗胰蛋白抑制剂(STI)多克隆抗体和小鼠抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体。SDS-PAGE和荧光检测结果显示,R-藻红蛋白分别与兔抗STI多克隆抗体和小鼠抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体成功交联。荧光标记物的免疫检测结果表明,R-藻红蛋白标记物能检测相关抗原的存在,且有较好的特异性。同时,R-藻红蛋白标记兔抗STI多克隆抗体的优化实验结果表明,当SPDP与R-藻红蛋白的摩尔比为80:1,SPDP与兔抗STI多克隆抗体的摩尔比为100:1时,两者交联效果最好,故R-藻红蛋白标记小鼠抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体也按此摩尔比进行。采用SPDP和2-四氢酚噻(2-IT)交联R-藻红蛋白与乙肝病毒表面抗体(Anti-HBs/F)、羊抗小鼠IgG和小鼠抗兔IgG。SDS-PAGE和荧光检测结果表明,R-藻红蛋白分别与乙肝病毒表面抗体、羊抗小鼠IgG和小鼠抗兔IgG成功交联。荧光标记物的免疫检测结果显示,R-藻红蛋白标记的Anti-HBs/F能检测到1.9μg/mL乙肝病毒表面抗原;R-藻红蛋白标记的羊抗小鼠IgG能检测到0.03 mg/mL的鲫鱼小清蛋白;R-藻红蛋白标记的小鼠抗兔IgG能检测到5.625μg/mL的章鱼原肌球蛋白。这些R-藻红蛋白荧光标记物均有较好的特异性,且荧光强度大。利用R-藻红蛋白荧光探针有望缩短免疫杂交的检测时间,简化操作过程。
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