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D-阿洛酮糖是一种自然界天然存在含量极少的稀有糖。D-阿洛酮糖具有零能量且与蔗糖相似的甜度和良好的加工特性,以及预防肥胖、降血脂、抗氧化、保护神经和抑制癌细胞等生理活性,在食品卫生和保健医药等领域具有巨大应用价值。全细胞反应可避免多步操作和耗时的酶纯化过程,然而,D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在高温下进行催化反应,催化结束后,常规的宿主如大肠杆菌、酿酒酵母等容易死亡,难以重复利用。为实现工程菌原位催化后的重复利用,本研究通过克隆D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因,构建高效表达载体,转入耐热的马克斯克鲁维酵母中成功实现了高效表达,通过全细胞反应,研究工程菌原位催化特性,采用生物法脱除混合液中的D-果糖,降低生产成本,提高工程菌的重复利用及D-阿洛酮糖的生产效率,初步论证工程菌再生循环催化D-果糖产D-阿洛酮糖的可行性,主要结果如下:(1)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的克隆及分析。以根癌农杆菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得目的基因,将其与T克隆载体连接,构建p UCm-T-dpe重组质粒,转入大肠杆菌DH5α,抽取质粒测序验证并分析。同源性分析显示,该基因与NCBI数据库中根癌农杆菌编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因NCIM:2942(序列号:KX098480.1)的核苷酸序列相似性为99.45%,氨基酸序列相似性为99.65%。经生物信息学分析,该蛋白为稳定亲水性蛋白,其相对分子质量31493.62,无跨膜区,不含信号肽,位于细胞膜的表面。二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%。三级结构显示DPE蛋白为四聚体结构,每个单体呈典型TIM桶状,由8个重复的(β/α)8结构组成。(2)重组马克斯克鲁维酵母的构建及酶学特性。通过酶切和T4连接酶连接的方法,构建真核表达载体p RS42H-dpe。通过醋酸锂转化法将该表达载体转入耐热的马克斯克鲁维酵母中,通过潮霉素抗性筛选、反转录PCR和酶活,筛选出了产DPEase酶活最高的重组菌K.marxianus No.4。重组菌K.marxianus培养48 h后,目的蛋白的表达量达到最大值0.35 mg/m L,酶活为6.5 U/m L。利用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化目的蛋白纯度达95%以上。酶学活性研究表明:Mn2+显著提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活;酶的最适温度和p H值分别为55℃和8.0。(3)生物法脱除催化反应液中D-果糖的研究。10g/L马克斯克鲁维酵母工程菌在55℃,p H 8.0条件下,可催化750 g/L D-果糖,产生190 g/L D-阿洛酮糖。对工程菌循环催化的可行性进行初步研究,工程菌利用残留D-果糖再生增殖,最终100 g的残留D-果糖被转化为34 g乙醇,并获得15 g K.marxianus工程菌和纯度达92%以上的D-阿洛酮糖。初步论证工程菌循环催化D-果糖生产D-阿洛酮糖的可行性。整合dpe基因的马克斯克鲁维酵母基因工程菌成功表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶,利用全细胞反应,研究工程菌原位催化特性,降低D-阿洛酮糖的生产成本,提高工程菌的重复利用。本研究从耐热马克斯克鲁维酵母工程菌原位催化后的重复利用和生物脱除D-果糖纯化D-阿洛酮糖两方面为D-阿洛酮糖的工业化生产提供参考。