舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,近年发病率呈上升及年轻化的趋势,目前以手术为主,放疗化疗为辅的综合治疗对舌鳞癌患者5年生存率没有明显的提高,仍徘徊在50%左右,中晚期患者的5年生存率更低,如何提高舌鳞癌患者的生存率和生存质量依然是一个世界性的难题,因此,十分有必要探寻更加安全有效的治疗方法来辅助加以破解。目前除了探索舌鳞癌早期发现的有效手段外,通过基因靶向治疗控制舌鳞癌的生长,增殖,侵袭和转移成为提高舌鳞癌五年生存率的有效策略,必将为最终控制舌鳞癌提供新的方法,因而,也成为当今舌鳞癌治疗领域研究的热点问题。Dicer酶是细胞内的重要基因,与细胞存活和胚胎发育有关；同时Dicer酶也是核糖核酸内切酶-Ⅲ (RNase Ⅲ)家族的关键成员,由Dicer基因编码,是RNA干扰途径中的关键组分,主要存在于细胞质中,在小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和微小RNA(microRNA, miRNA)的产生过程中起着重要的作用,并与其酶切产物siRNAs及miRNAs及其他蛋白复合物在多种生物过程中起调节作用,包括细胞增殖、分化、凋亡、侵袭迁移及死亡等等。其中siRNA与RNA干扰有关,是机体的一种关键的抗病毒机制。miRNAs是一类大小约～22nt的保守非编码RNA,它通过促进RNA降解或者抑制翻译来调控靶基因的表达。近年来的研究发现miRNAs在多种肿瘤中异常表达,并且这些基因在一定意义上作为潜在的癌基因或抑癌基因参与了肿瘤的发生发展过程,在肿瘤的发生过程中,当miRNAs与癌基因相互作用时,其表达量下调,导致癌基因激活；当miRNA与抑癌基因相互作用时,其表达量上调,导致抑癌基因失活。不同的肿瘤中miRNAs的表达谱改变不同,如部分miRNAs表达上调,部分miRNAs表达下调,但是,在人类的大部分肿瘤中miRNAs的表达普遍降低,而这种降低在肿瘤的发展过程中是起主导作用,还是仅仅反映了肿瘤的未分化状态,还不是很清楚。作为miRNAs的加工酶,Dicer酶的在不同的肿瘤中表达也不同,在某些肿瘤中,Dicer酶表达下调,而在另一些肿瘤中,Dicer酶的表达却上调,作为miRNAs的上游调控器,Dicer表达的变化可能会通过改变了miRNAs的表达谱而影响肿瘤的生物学行为。许多证据表明这些能够调节miRNA量改变的功能性基因与人类肿瘤的发生有关：如在肺部的非小细胞肺癌中niRNA let-7与Ras,在慢性淋巴细胞白血病中miR-15a、 miR-16-1与bcl-2[8];在乳腺的肿瘤中miR-21与PDCD4和TPM1等。由于Dicer酶既是正常机体运作中的关键基因,其表达的变化又与肿瘤的发生发展紧密联系,正是Dicer酶这种作用的不确定性,使研究者已把它作为RNA干扰治疗的重点进行研究。2005年Karub等首次报道Dicer与人类肿瘤的相关性,他们研究发现Dicer在非小细胞肺癌中的表达下调,并明确其表达与临床病理特征及预后密切相关。之后越来越多的学者着手研究Dicer酶与肿瘤之间的相关性,现更有学者通过体外干扰Dicer基因的表达以验证Dicer酶在肿瘤发生发展中的作用,而在舌鳞癌细胞中Dicer酶的表达及其作用尚不清楚。因此,本研究通过体外靶向沉默人舌鳞癌细胞Tca-8113细胞中Dicer基因的表达,进一步观察细胞的体外增殖,细胞周期,粘附、侵袭及迁移等生物学行为的变化,以探讨Dicer酶基因沉默对肿瘤发生发展中所起的作用,为寻求控制舌鳞癌的发生发展提供新的靶点,并为将来进一步的研究提供实验基础。本研究包括以下三部分：第一部分Dicer酶在舌鳞癌细胞中的表达及意义目的：1.探讨Dicer在舌鳞癌细胞株中的表达及意义。材料和方法：1.选取两株侵袭转移能力不同的舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞和UM-1细胞,并以正常口腔上皮细胞作为对照。2.应用免疫细胞化学染色技术及Western blot检测舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞、UM-1细胞及正常口腔上皮细胞的Dicer酶的蛋白质表达水平。3.应用实时定量RT-PCR检测Tca-8113细胞、UM-1细胞及正常口腔上皮细胞的Dicer酶的mRNA的表达水平。结果：1.免疫细胞化学染色法表明,Dicer酶在正常口腔上皮细胞胞浆中的染色最深,在UM-1细胞胞浆中的染色最浅；Western blot分析表明Dicer酶在舌鳞癌细胞株Tea-8113细胞和UM-1细胞中的蛋白质表达水平较正常口腔上皮细胞明显下降(P<0.05),其中UM-1的Dicer酶蛋白质表达水平又较Tca-8113下降(P<0.05)。2.实时定量RT-PCR进一步在mRNA水平上证实了Dicer酶在舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞和UM-1细胞中的表达较正常口腔上皮细胞下降(P<0.05),而两株舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞和UM-1细胞中的Dicer酶mRNA水平无显著性差异(P>0.05)。小结：1.Dicer酶在舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞和UM-1细胞中的蛋白质水平与正常口腔上皮细胞相比表达下调。2.Dicer酶在舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞和UM-1细胞中的mRNA水平与正常口腔上皮细胞相比表达下调。第二部分舌鳞癌细胞Tca-8113细胞体外转染Dicer-siRNA及干扰率检测目的：1.构建沉默Dicer基因的细胞模型,将Dicer-siRNA体外转染舌鳞癌细胞Tca-8113细胞,并观察转染率及检测干扰率。2.为沉默Dicer基因后检测舌鳞癌细胞Tca-8113细胞生物学行为变化的实验做准备。材料和方法：1.根据前期结果,以舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞作为实验对象,构建沉默Dicer基因的细胞模型,确定分组,采用脂质体介导法,用Lipofectamine RNAiMAX将小干扰片段Dicer-siRNA转染入Tca-8113细胞,采用荧光倒置显微镜观察荧光FAM标记的siRNA转染效率。2.实时定量RT-PCR检测转染后Tca-8113细胞中Dicer酶的：mRNA表达变化。3.免疫细胞化学染色和Western blot分析转染后Tca-8113细胞中Dicer酶的蛋白质表达变化。结果：1.荧光倒置显微镜镜下观察显示100nM浓度的FAM标记siRNA转染情况良好。2.实时定量RT-PCR测显示,实验组Dicer酶的mRNA水平下调,抑制率约61.4%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.免疫细胞化学染色可见,转染Dicer-siRNA后,Tca-8113细胞胞浆中的Dicer蛋白质染色与对照组相比明显变浅；Western blot检测显示实验组Dicer酶的蛋白质表达下调,抑制率约为57.4%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。小结：1. Dicer-siRNA能有效地干扰Dicer酶在舌鳞癌细胞株Tca-8113中的蛋白质和mRNA水平的表达。第三部分沉默Dicer基因对舌鳞癌细胞株Tca-8113的细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响目的：1.探讨Dicer酶在舌鳞癌细胞Tca-8113增殖、侵袭迁移中的作用。材料和方法：1.构建沉默Dicer基因的细胞模型,将Dicer-siRNA转染舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞,同时设阴性对照组及空白组。2.沉默Dicer基因后,MTT法检测Dicer酶对Tca-8113细胞体外增殖的影响,流式细胞术检测Dicer酶对Tca-8113细胞的体外细胞周期的影响。3.沉默Dicer基因后,粘附实验、细胞划痕实验及Transwell侵袭迁移实验检测Dicer酶对Tca-8113细胞体外侵袭迁移能力的影响。结果：1.MTT法检测结果显示转染后24h及48h,实验组的细胞体外增殖活性与对照组相比有显著差异,即转染Dicer-siRNA后,Tca-8113细胞的增殖活性与对照组相比明显升高(P<0.05),而转染后72h,Dicer-siRNA效应减弱,实验组细胞的增殖活性与对照组相比,差异不显著(P>0.05)。流式细胞术检测结果,与对照组相比,转染Dicer-siRNA后,Tca-8113细胞的G1期缩短,G2期和S期延长,表明体外Dicer基因沉默后,Tca-8113细胞的细胞周期向G2期及S期推进,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.粘附实验、细胞划痕实验及Transwell侵袭迁移实验结果表明,Tca-8113细胞转染Dicer-siRNA后,细胞的体外粘附、侵袭、迁移能力均较对照组有明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结：1.沉默Dicer基因的表达可促进Tca-8113细胞的体外增殖能力、促使细胞周期向S期推进。2.沉默Dicer基因的表达可促进Tca-8113细胞的体外侵袭及迁移能力。全文结论1.本研究选取的两株舌鳞癌细胞株Tea-8113细胞和UM-1细胞中Dicer酶的蛋白质和mRNA的表达水平均较正常口腔上皮细胞下调。2.应用小干扰片段Dicer-siRNA可体外有效地干扰Dicer在舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞中的蛋白质水平和mRNA水平；3.体外沉默Dicer基因在舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞中的表达可促进细胞的体外生长、增殖、侵袭及迁移能力。