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目的探讨雷公藤甲素对RA-HFLS Ras-MAPKs及G蛋白-cAMP信号传导通路的影响,并揭示上述两条信号传导通路之间的相互联系,为雷公藤治疗RA的分子机制和临床合理应用提供实验依据。方法将不同浓度的TP(0.28、2.8、28、140 nM)与TNF-α诱导及未诱导的RA-HFLS共孵育,采用MTS比色法检测细胞增殖活性,以观察TP对RA-HFLS增殖的影响；通过Western blot方法检测RA-HFLS Ras-MAPKs信号传导通路相关蛋白(Ras、p-P38、p-ERK和p-JNK)的活化水平及G蛋白-cAMP信号通路中Gi、Gs表达水平,并采用RT-PCR方法检测Gi、GsmRNA转录水平,应用放射免疫分析法检测cAMP含量,以研究TP对RA-HFLS Ras-MAPKs及G蛋白-cAMP信号传导通路的影响：选用G蛋白-cAMP信号传导通路激活剂(Gs激活剂CT、Gi抑制剂PT)和Ras-MAPKs信号通路的抑制剂(P38通路选择性抑制剂SB203580、ERK通路选择性抑制剂PD98059及JNK通路选择性抑制剂SP600125)预处理RA-HFLS 1h后加入TNF-a诱导不同时间,通过Western blot方法检测上述两条通路主要蛋白表达水平,以探讨两信号通路间的相互联系(cross talk)。结果1.TP对RA-HFLS增殖的影响与空白组相比,经TNF-α(10ng／mL)诱导后细胞相同传代时间下,其形态及状态与空白组相似,但密度明显增加；与TNF-a诱导组相比,不同浓度TP作用24 h后细胞数量明显减少,并出现不同程度的变形,36h～48h后,TP 28、140 nM组细胞变圆变小,并可见细胞碎片；TNF-a诱导可明显提高细胞的增殖活性(P<0.01),0.28 nM TP对RA-HFLS增殖无明显影响(P>0.05),TP(2.8 nM～140 nM)可显著抑制RA-HFLS的增殖(P<0.05或P<0.01),其抑制率分别为5.05%、30.83%和43.77%,且呈现显著的剂量依赖性(P<0.01)。2.TNF-α诱导不同时间对RA-HFLS Ras-MAPKs信号传导通路活化水平的影响TNF-α短时间即可引起Ras-MAPKs信号传导通路的活化,P38、ERK、JNK磷酸化水平显著升高,15 min达高峰(P<0.05或P<0.01),其中p-ERK蛋白的表达最强,是空白组的3.15倍,p-JNK表达水平是空白组的2.78倍,p-P38表达最弱,仅为空白组的1.95倍。3.TP对RA-HFLS Ras-MAPKs信号传导通路活化水平的影响与空白组相比,TNF-α可显著提高RA-HFLS Ras、p-P38、p-ERK及p-JNK的表达(P<0.01)；与单纯TNF-α诱导组相比,2.8 nM TP可显著抑制TNF-α诱导的RA-HFLS Ras、p-P38、p-ERK及p-JNK的表达(P<0.05),随着TP浓度的升高,这种抑制作用也随之增强(P<0.05或P<0.01),且TP不同浓度组之间比较,差异具有显著性(P<0.05),当TP浓度达140 nM时,对上述蛋白表达的抑制率可分别达62.6%、57.5%、66.9%、59.0%；与空白组比较,2.8 nMTP对未经TNF-α诱导的RA-HFLS Ras、p-P38、p-ERK及p-JNK的表达无显著影响(P>0.05),而当其浓度由28 nM升至140 nM,TP表现出显著抑制作用(P<0.05或P<0.01),其中140 nM TP对上述各蛋白的抑制率可达32.0%、32.9%、33.9%、19.7%,但TP不同浓度组之间比较,差异不具有显著性(P>0.05)；TNF-α诱导给药组与TNF-α未诱导给药组比较,2.8 nM TP对RA-HFLS Ras、p-P38及p-ERK表达的抑制率两组无统计学差异(P>0.05),只对p-JNK的抑制率两组有统计学差异(P<0.05)；28 nM TP对RA-HFLS Ras及p-P38表达的抑制率两组无统计学差异,对p-ERK及p-JNK的抑制率两组有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；而140 nM TP对上述蛋白表达的抑制率两组均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4.TP对RA-HFLS Gi2、Gi3和Gs蛋白表达水平的影响与空白组相比,TNF-α诱导6h可显著上调Gi2、Gi3蛋白表达,同时下调Gs表达(P<0.01)；与单纯TNF-α诱导组相比,2.8 nM TP可显著抑制TNF-α诱导的RA-HFLSGi2的表达(P<0.05),但对Gi3的抑制作用无统计学差异(P>0.05),并显著上调Gs表达(P<0.01),且随着TP浓度的升高,这种抑制作用或增强作用也随之增强,当TP浓度达140 nM时,对Gi2、Gi3蛋白的抑制率可分别达49.2%、54.1%,而对Gs表达上调率可达90.3%,同时TP不同浓度组之间比较,除中剂量与高剂量组对Gi2的抑制作用及对Gs的增强作用无统计学差异外,其他各组间比较,TP对Gi2、Gi3的抑制作用与对Gs的增强作用均具有组间显著性差异(P<0.05或P<0.01)；与空白组相比,2.8 nM TP即可显著抑制未经TNF-a诱导的RA-HFLS Gi2与Gi3的表达(P<0.05或P<0.01),而对Gs表达的增强作用无统计学差异,当TP浓度由28 nM升至140 nM,其表现出的抑制或增强作用也随之增强(P<0.05或P<0.01),其中140 nM TP对Gi2与Gi3的抑制率可达44.6%、30.4%,对Gs表达上调率可达17.2%,TP不同浓度组间比较显示,相邻的剂量组间没统计学差异,而低剂量与高剂量之间则表现出显著性差异(P<0.05)；TNF-a诱导给药组与TNF-a未诱导给药组比较,2.8 nM TP对RA-HFLS Gi2、Gi3表达的抑制率两组无统计学差异(P>0.05),对Gs表达的上调率两组有统计学差异(P<0.05)；28 nM TP对RA-HFLS Gi2、Gi3表达的抑制率两组无统计学差异(P>0.05),对Gs表达的上调率两组有统计学差异(P<0.01)；而140 nM TP对Gi2表达的抑制率两组无统计学差异(P>0.05),对Gi3表达的抑制率与对Gs表达的上调率两组有统计学差异(P<0.01)。5.TP对RA-HFLS Gi和Gs转录水平的影响与空白组相比,TNF-α诱导6h可显著上调GimRNA表达,同时下调GsmRNA表达(P<0.01)；与单纯TNF-α诱导组相比,2.8 nM TP即可显著抑制TNF-α诱导的RA-HFLSGimRNA转录水平,并显著上调GSmRNA表达(P<0.01),且随着TP浓度的升高,这种抑制作用或上调作用也随之增强(P<0.01),当TP浓度达140 nM时,对Gi mRNA转录水平的抑制率可达98.1%,而对GsmRNA转录水平上调率可达233.3%。同时TP不同浓度组之间比较,除低剂量与中剂量组对Gi基因转录的抑制作用无显著性差异,同时中剂量与高剂量组对Gs表达的增强作用无显著性差异外,其他各组间比较,均具有组间显著性差异(P<0.05或P<0.01)；与空白组相比,140 nM TP对TNF-α未诱导的RA-HFLS Gi mRNA转录水平的抑制率可达96.7%,而对GsmRNA转录水平上调率可达40.0%(P<0.05)；TNF-α诱导给药组与TNF-α未诱导给药组比较,140 nM TP对Gi mRNA转录水平的抑制率两组无统计学差异(P<0.05),而对GsmRNA转录水平上调率两组有统计学差异(P<0.01)。6.TP对RA-HFLS cAMP含量的影响与空白组相比,TNF-a诱导6h可显著下调RA-HFLS胞浆cAMP含量,其下调率为12.5%；而TP可显著上调TNF-α诱导引起的RA-HFLS cAMP含量的降低,低、中、高剂量上调率分别为10.4%、18.8%、33.3%,呈现出剂量依赖性,同时与空白组相比,140 nM TP也可显著升高未诱导的RA-HFLS cAMP水平(P<0.05或P<0.01)。7. Ras-MAPKs与G蛋白-cAMP信号传导通路在RA-HFLS中的交互调节Gi蛋白抑制剂PT(1μg／mL)和Gs蛋白激活剂CT(10μg／mL)可有效抑制TNF-α(10μg／mL)诱导的RA-HFLS Ras、p-P38、p-ERK和p-JNK蛋白表达水平的上调；P38通路抑制剂SB203580(10μM)、ERK通路抑制剂PD98059(50μM)及JNK通路抑制剂SB600125 (25μM)可有效抑制TNF-α诱导的RA-HFLS Gi2、Gi3蛋白表达水平的升高,并逆转Gs表达水平的降低。结论：1.TNF-α可明显诱导RA-HFLS的增殖,并引起Ras-MAPKs信号传导通路的异常活化及G蛋白-cAMP信号通路的异常抑制。2.TP可显著抑制TNF-α诱导的RA-HFLS的增殖。3.TP可降低ERK、JNK和P38的磷酸化和Ras表达水平,从而抑制RA-HFLS Ras-MAPKs信号传导通路的异常活化。4.TP可调节Gi和Gs的失衡,提高cAMP水平,从而调节G蛋白-cAMP信号通路的失衡。5.Ras-MAPKs信号传导通路与G蛋白-cAMP信号通路间存在着交互调节关系。6.TP一方面直接抑制Ras-MAPKs信号传导通路的异常活化并调节G蛋白-cAMP信号通路的失衡,另一方面通过影响一条通路的活化,间接抑制另一条通路,这可能是雷公藤抑制RA滑膜过度增殖,减轻滑膜炎症抗RA关节损伤的部分分子机制。