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目的:津白2小鼠(Tientsin Albino II,TA2)是天津医科大学培育成功的高发乳腺癌纯系小鼠,是被国际小鼠遗传标准命名委员会(International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice,ICLAS)和我国卫生部承认的近交系小鼠。自发性乳腺癌是TA2小鼠的主要特征,不经过任何人工处理,经产TA2母鼠的乳腺癌发生率为81%。与其他类型的小鼠模型相比,TA2自发性乳腺癌最突出的优点是能够反映乳腺癌的自然进程。肿瘤的克隆演化(clonal evolution)是指在自然选择作用下,具有不同基因突变的肿瘤细胞相互竞争,肿瘤由起始的单一克隆,演变为多个亚克隆,这类似于物种的达尔文进化过程。既往研究显示不同类型乳腺癌的基因组的克隆演化具有各自的特征,TA2小鼠的遗传背景相同,其自发性乳腺癌的克隆演化具有什么特点尚不清楚。为了揭示TA2自发性乳腺癌的克隆演化特征,本研究首先明确了TA2自发性乳腺癌的病理学特征和分子分型;对4个TA2自发性乳腺癌标本进行了全基因组重测序,分析比较样本之间的克隆结构和克隆演化特点;另外,在本研究中初步验证了TA2小鼠DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)修复机制的缺陷。方法:1.收集17例TA2自发性乳腺癌样本,观察小鼠的见瘤时间、产次和肿瘤发生部位;HE染色观察TA2自发性乳腺癌的病理学特点;应用免疫组织化学染色检测ER、PR、HER2、EGFR,确定TA2自发性乳腺癌的分子分型;应用免疫组织化学染色检测Ki67的表达情况,评估TA2自发性乳腺癌的增殖活性。2.选取4例TA2自发性乳腺癌(R01、R02、R03、R04)样本,其中R01和R02来源于同一只TA2小鼠,R01是原发性乳腺癌,R02是颈背部转移性乳腺癌,R03和R04分别来自另外2只TA2,均为原发性乳腺癌;4个样本的病理学类型均为浸润性导管癌,其中R03的组织学分级为3级,其余3个样本均为2级;4个样本的分子分型均为基底细胞样乳腺癌。对TA2自发性乳腺癌和鼠尾DNA进行全基因组重测序,参考基因组为Mouse.C57BL/6J,进行以下生物信息学分析:(1)检测和注释单核苷酸变异(Single Nucleotide Variation,SNV)、小片段插入/缺失(small In Del)、结构变异(Structure Variation,SV)和拷贝数变异(copy number variation,CNV)等遗传学变异;并对变异的基因进行功能注释,筛选出TA2自发性乳腺癌相关的遗传学变化。(2)根据SNV、CNV和LOH等遗传变异,应用Sci Clone方法和EXPANDS方法进行TA2自发性乳腺癌的克隆演化研究。3.原代培养TA2小鼠、TA1低瘤鼠和C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs),应用博来霉素处理各MEFs,造成人为的DSBs,应用免疫荧光检测γ-H2AX,比较TA2与其他种系小鼠的DSB修复能力的不同;应用双抗体夹心ELISA法检测TA2、TA1和C57BL/6小鼠的血清Ig A水平,比较TA2与其他种系小鼠的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)能力的不同。结果:1.17例TA2自发性乳腺癌小鼠的平均见瘤鼠龄为315±71天;荷瘤鼠均为经产母鼠,平均分娩次数为3.06±1.12次;肿瘤好发部位依次为右前胸(8例)、右下腹(4例)、左下腹(4例)和左前胸(1例),另有2例合并颈背部肿瘤,其他部位未见肿瘤。17例TA2自发性乳腺癌在组织病理学上均与人乳腺浸润性导管癌类似;大多数样本的组织学分级为2级,除了1例的组织学分级为3级;分子分型均类似于人基底细胞样乳腺癌的表型:ER、PR和HER2均为阴性,EGFR阳性表达;TA2自发性乳腺癌Ki67高表达,细胞增殖活性高。2.对全基因组测序数据进行分析,包括遗传变异分析和克隆演化分析两部分。(1)遗传变异分析:与参考基因组相比,TA2自发性乳腺癌存在一系列的SNVs、In Dels、CNVs和SVs等遗传学变异。全基因组范围内,4个样本的SNVs均以C>T或T>C为主;韦恩(Venn)分析显示,全基因组范围内,4个样本之间99.02%SNVs是相同的,95.45%In Dels是相同的。对蛋白编码区(coding sequence,CDS)区域发生变异的基因进行功能注释,共分为25类不同功能的基因,4个样本之间每类基因的变异基因数目基本一致。结合基因功能注释,我们对参与DSBs修复的两个经典通路——同源重组(homologous recombination,HR)和NHEJ的基因进行分析,发现4个样本中均发生相同的DSB修复相关基因Brca2、Rad52、Rif1和Trp53bp1的基因突变;结合文献,对16个乳腺癌相关的DNA修复相关基因进行分析,发现4个样本中均发生相同的Trp53、Kmt2c基因突变。(2)克隆演化分析:应用Sci Clone方法分析发现,4个样本均含有6个亚克隆,对4个样本两两比较发现,各个亚克隆的等位基因频率(variant allele frequency,VAF)差别不大,提示4个样本的亚克隆结构类似;应用EXPANDS方法分析发现,4个样本均有11个亚克隆,4个样本各亚克隆的系统发生树均呈“树状”结构,提示4个样本的克隆演化模式相类似。3.(1)博来霉素处理MEFs后,γ-H2AX在细胞核内呈点状聚集(foci)。去除博来霉素4h后,TA2、TA1和C57BL/6 MEFs的γ-H2AX聚集点的平均数目分别为23.96±7.19、21.52±6.80和21.30±6.47,两两比较3种MEFs的γ-H2AX聚集点数目,组间差异没有统计学意义(P>0.05)。去除博来霉素24h后,TA2、TA1和C57BL/6 MEFs的γ-H2AX聚集点的平均数目分别为5.98±2.27、1.22±0.98和1.32±0.79,TA1和C57BL/6 MEFs的γ-H2AX聚集点数目的差异没有统计学意义(P>0.05);分别与TA1和C57BL/6 MEFs相比,TA2 MEFs的γ-H2AX聚集点数目更多(P<0.05),显示TA2 MEFs产生的γ-H2AX聚集点消失的更慢,提示TA2小鼠存在DSB修复缺陷。(2)TA2、TA1和C57BL/6小鼠血清的Ig A浓度分别为418.60±47.18μg/m L、472.69±36.46μg/m L、470.34±37.49μg/m L。TA1和C57BL/6小鼠血清中Ig A水平的差异没有统计学意义(P>0.05);分别与TA1和C57BL/6相比,TA2小鼠血清中Ig A水平下降(P<0.05),提示TA2小鼠可能存在NHEJ缺陷。结论:本研究初步证实TA2自发性乳腺癌不同个体之间在组织病理学类型、分子分型、遗传变异和克隆演化等方面类似,具体表现在:(1)病理学类型类似于人乳腺浸润性导管癌,大部分的组织学分级为2级;(2)分子分型均为基底细胞样乳腺癌;(3)全基因组的遗传变异类似,具有相同的DSB修复基因突变。(4)克隆演化分析显示TA2自发性乳腺癌的克隆结构和克隆演化类似。基于以上证据,我们推测TA2自发性乳腺癌基因组的克隆演化存在某种相对固定的模式。本研究还初步证实了TA2可能存在DSB修复缺陷,这可能是TA2自发性乳腺癌形成的一个重要原因。