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Subtilases （Subtilisin-like serine proteases,枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶）是广泛存在于细菌、古生菌以及真核生物中的一类丝氨酸蛋白酶,它在生物体的多种生理活动中发挥着重要的作用,例如蛋白质代谢、酶原活化等。Subtilases通常以无活性的前体形式合成,必须经历加工成熟过程才能转变为有活性的成熟酶,这种加工成熟的过程能够精确调节Subtilases活性的释放及功能的发挥。嗜热Subtilases是研究酶的温度适应机制的重要实验材料,同时也在工业应用上具有重大潜能,因而受到了人们的广泛关注。对适应不同温度的Subtilases的加工成熟过程的研究,不仅能帮助我们更好地理解它们的温度适应机制,同时也为在工业应用中制备有活性的Subtilases提供更多有价值的信息。嗜热蛋白酶WF146是来源于嗜热细菌Bacillus sp. WF146中的一种胞外Subtilases。它在细胞内以前体的形式合成,包括信号肽、N端前肽和成熟酶区三部分。我们以大肠杆菌为宿主对WF146蛋白酶进行异源表达,产生的WF146蛋白酶酶原以可溶形式存在于细胞内。该酶原（43kDa）在60℃保温时,可以自加工去除N端前肽而转变为32kDa的成熟酶,说明重组酶原已经折叠为正确结构。本论文将在此基础上开展嗜热蛋白酶WF146加工成熟的分子机制研究。首先,我们研究了WF146蛋白酶可能的成熟途径,通过构建该酶活性位点突变体来捕捉成熟过程中可能存在的加工产物及中间体。研究结果显示：当WF146蛋白酶的活性位点Ser249突变为Ala后,该突变体丧失成熟的能力,表明活性位点是酶原去除N端前肽所必需,确定WF146蛋白酶酶原的自加工成熟过程依赖于其自身成熟酶区的活性；当活性位点Ser249突变为Cys后,WF146蛋白酶可以自加工为33kDa的中间体,但是不能进一步加工为成熟酶；当野生型酶原在有丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）存在的情况下于60℃保温时,我们观察到酶原成熟过程中有33kDa的中间体的积累。这些实验结果表明,WF146蛋白酶酶原在自催化（Auto-catalytic）成熟过程中经历了一个中间体阶段,在此过程中对N端前肽的加工采用的是两步加工机制。首先,N端前肽的主体部分（N*）被成熟酶区活性位点顺式加工（cis-processing）,形成中间体；然后,N*与成熟酶区之间的连接肽段被截短,中间体转变为成熟酶。此外,WF146蛋白酶酶原的自催化成熟还能通过成熟酶对酶原中N*与成熟酶区之间的连接肽段进行反式加工（trans-processing）来进行。我们还发现,与大多数其他Subtilases不同,WF146蛋白酶的成熟过程除了可以依靠自身成熟酶区的活性来引发之外,也可以依靠外源蛋白酶的活性来引发。通过圆二色谱分析,我们发现WF146蛋白酶在加工成熟过程中发生细微结构调整。通过限量酶解实验,我们发现酶原中N端前肽部分对蛋白酶降解敏感,而成熟酶区则十分稳定,这一结构特点使得酶原可以通过反式加工去除N端前肽而完成成熟过程。其次,我们对Ca2+在WF146蛋白酶加工成熟过程中的作用进行了详细研究。WF146蛋白酶与嗜冷蛋白酶S41和嗜温蛋白酶Sphericase分别具有68%和67%的氨基酸序列一致性,后两种酶中均含有相同的五个Ca2+结合位点。通过氨基酸序列比对我们发现WF146蛋白酶至少含有四个与之相对应的Ca2+结合位点。Ca2+对WF146蛋白酶的活性、稳定性及加工成熟过程都具有重要作用。在螯合剂EDTA存在时,WF146蛋白酶酶原在60℃可以顺式加工为一种特殊的N端前肽-中间体复合物,这种中间体不能进一步加工为成熟酶,而是在降低温度或（和）加入Ca2+后能够与N端前肽重新连接为酶原。通过圆二色谱法分析,我们发现当除去溶液中的Ca2+后,WF146蛋白酶酶原的结构变得不稳定。这些结果说明,Ca2+具有维持WF146蛋白酶的结构稳定性的作用,酶原分子通过结合Ca2’形成稳定结构而保证加工成熟过程的顺利进行。最后,我们对WF146蛋白酶的N端前肽功能进行了研究,同时对它成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段（12个氨基酸残基）进行了突变及功能分析。结果表明,WF146蛋白酶酶原中的N端前肽能够作为分子内伴侣协助成熟酶区正确折叠,同时也是成熟酶的活性抑制剂。WF146蛋白酶成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段对N端前肽分子内伴侣及活性抑制剂功能没有影响。这段连接肽段中富含带负电荷的Glu残基（5个）,将这5个Glu残基同时突变为其它类型的氨基酸残基（分别突变为Gln, Ala, Gly, Lys）后并未影响到成熟酶的性质,但是会使酶原成熟过程加快。当我们对连接肽段进行缺失突变后,WF146蛋白酶酶原的折叠及加工过程受到影响。我们推测该连接肽段在酶原的加工成熟过程中具有调节作用,保证该酶在合适的时间和位置释放活性,避免过早释放蛋白酶活性而对细胞造成损害。