Streptomyces sp.HS-NF-780和Streptomyces sp.HS-NF-1542活性代谢产物研究

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放线菌次级代谢产物是药物先导化合物的重要来源。由于放线菌易选育,培养发酵周期短,比较容易进行代谢调控,可以通过大规模发酵进行工业化生产,历来是抗生素生产中最多产的类群。而土壤又是放线菌分布最丰富的场所,因此,土壤放线菌次级代谢产物研究具有重要的生物学价值和社会价值。本研究选用采自不同生境的土壤作为放线菌分离源,对分离得到的放线菌进行发酵,对发酵产物进行提取分离及结构鉴定,并对次级代谢产物的绝对构型进行研究,结果如下:(1)选用两种分离培养基(HV、GS)对采自伊春市百年红松树根际、临沂市地黄根际、阳朔深山环境的土壤进行放线菌分离,共得到40株放线菌。以白色念珠菌、表皮葡萄球菌、水稻纹枯致病菌和大豆菌核致病菌为拮抗指示菌对40株放线菌进行生长抑制实验。结果显示:37.5%的放线菌对指示细菌具有抑制活性,32.2%的放线菌对至少1种致病真菌具有抑制活性。对抑制真菌效果明显或抑制细菌效果较好的17株活性放线菌采用GYM和H9两种发酵配方进行摇瓶发酵实验,对其发酵液粗提物再次进行抑菌活性筛选,并以人结肠癌细胞HCT-116为筛选模型,采用SRB的方法检测抑制肿瘤细胞活性。结果显示:在100μg/mL样品浓度下,有8株放线菌对HCT-116抑制率在50%以上,在20μg/mL样品浓度下有3株放线菌对HCT-116抑制率依然大于50%。(2)对筛选得到的两株放线菌Streptomyces sp.HS-NF-780和Streptomyces sp.HS-NF-1542进行放大发酵,发酵液经过抽滤、离心、大孔树脂吸附等方法前处理后,然后通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC制备等一系列分离纯化手段和1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、高分辨质谱等化合物鉴定方法,共获得9个化合物。从链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-780共分离到7个化合物1-7,其中1-6均为戊二酰亚胺类化合物,化合物1,3,4为具有新颖结构化合物,分别命名为hydroxyiso-9-methylstreptimidone,9-methylstreptimidone2-α-D-glucopyranoside,(2E,6E,8E)-3’-(1’-amino-1’-oxoethyl)-11,12-dimethyl-4-oxotrideca-2,6,8-trienoic acid;从链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1542中分离2个已知化合物8-9,分别为丁烷内酯类化合物和二萜类化合物。(3)对化合物1,3绝对构型进行研究。通过改进的Mosher法确定了化合物1在C-2位置的绝对构型为R,发现化合物1在C-9位置为差向异构体,进一步对化合物1进行手性色谱柱分析,确定化合物1为混合物,混合比例约为3:2。对化合物3进行酸水解反应,得到糖苷配基和糖基两部分,通过液相分析糖苷配基部分与化合物2液相分析保留时间一致,确定了化合物3糖苷配基部分与化合物2结构相同,即为9-methylstreptimidone。对糖基部分和标准D-Glucose进行衍生反应,并对衍生产物进行液相分析,两者具有一致的保留时间,确定了化合物3所连接单糖构型为D-Glucose。(4)对新化合物1,3,4进行抗菌活性检测,结果显示:化合物1对大豆菌核致病菌具有一定的抑制效果;化合物4对白色念珠菌和大豆菌核致病菌具有一定的抑制效果。采用CCK8法对新化合物1,3,4进行抗肿瘤细胞活性检测。结果显示:新化合物1,3,4对人白血病细胞K562,乳腺癌细胞MCF-7,结肠癌细胞HCT-116均有适中的抗肿瘤活性,化合物1,3,4对人白血病细胞K562的IC50值分别为36.47、28.37、10.50μg/mL;对乳腺癌细胞MCF-7的IC50值分别为34.68、28.79、15.43μg/mL;对结肠癌细胞HCT-116的IC50值分别为36.76、34.83、20.49μg/mL。
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