论文部分内容阅读
糖尿病(DM)是胰岛素分泌、作用或二者均有缺陷所致的以高血糖为特征的一组代谢性疾病。流行病学调查表明DM是病死率最高的前三位严重疾病之一,目前全球糖尿病患者为1.48亿,预测到2025年将上升为3亿,以发展中国家患病率居高,目前,我国糖尿病仅次于印度已成为世界第二大糖尿病国家。糖尿病并发心血管病发生的危险性较一般人群高2~4倍,国外报道血管病变占DM死亡原因的65%~75%,且发病年龄提前,成为糖尿病致死、致残和医疗费用增高的一个主要原因。
糖尿病大血管病变病理基础是动脉壁粥样硬化(AS)。血管内皮损伤被认为是AS的始动和关键性环节,其发病机制涉及诸多因素,目前比较公认有非酶糖化学说、脂代谢紊乱学说、炎症学说以及氧化应激学说,其中氧化应激一直是国内外研究的热点。
活性氧(ROS)造成的氧化损伤称之为氧化应激,ROS主要有过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)和一氧化氮(nitricoxide,NO)等,在引起内皮细胞结构及功能障碍的自由基中,NO的作用倍受关注,以往仅注意到内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达对于维持血管正常生理功能的作用,近来随着内皮细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的克隆,以及炎症及感染因素参与各种心血管疾病发生机制被揭示,由炎性细胞因子诱导产生的高浓度NO,其本身的细胞毒对血管内皮细胞的损伤作用受到人们广泛的关注。而高浓度NO与超氧阴离子(O2-)发生快速非酶促化学反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)及其衍生物,具有更强的氧化作用,ONOO-可能是NO过量生成时导致细胞损伤的关键物质。资料表明糖尿病时,在血管内皮组织及血浆中细胞因子TNF-α、IL-1β的表达量增加,TNF-α、IL-1β可诱导iNOS的表达,但TNF-α、IL-1β是否通过诱导iNOS、ONOO-介导的氧化应激途径参与糖尿病血管内皮损伤,未见系统研究报道。
祖国医学认为消渴病以阴虚为本。阴虚致消渴成为大多数医家论治消渴病的主要病理基础;并有消渴必瘀,瘀可致消的说法。该病属本虚标实,虚实夹杂之证,以气阴两虚为本,脉络瘀阻为标。以此为治则,确立活血养阴方药(PBFNR)来防治糖尿病血管内皮损伤,以期达到标本兼治的目的。
氨基胍(AG)是一类具有亲核作用的肼化合物,是iNOS的选择性抑制剂,能特异抑制iNOS的活性,使NO及O2-生成减少,从而减少NO和O2-快速反应后生成的ONOO-。作为本实验阳性对照药。
本实验从整体水平,采用链脲菌霉素(STZ)复制大鼠糖尿病模型,运用HE染色,电镜技术分别观察主动脉一般形态学和超微结构变化,用试剂盒检测大鼠炎症介TNF-α与IL-1β含量变化及其他生化指标变化,运用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)技术检测、iNOSmRNA表达及免疫组化法检测iNOS蛋白含量,NT含量的变化,以期探讨炎症介质TNF-α、IL-1β、iNOS及ONOO-对主动脉形态与功能的影响及中药对其防治机制。
方法:
1、动物分组及取材:本实验选用6月龄SpragueDawley(SD)雄性大鼠37只,体重(234.16±28.78)g,随机分为4组,即正常对照组(8只),病理对照组(9只),氨基胍(AG)阳性对照组(8只),中药(PBFNR)组(12只),后3组腹腔内一次注射STZ(40mg/kg体重,溶于0.1mol/L枸橼酸钠/枸橼酸缓冲溶液,pH4.4,新鲜配制,浓度10mg/ml)溶液,制成DM模型(血糖高于13mmol/L,尿糖+++以上)。在20~25℃室温下,持续饲养13周,并在13周时再次检测血糖、尿糖、体重一次。13周后,禁食12小时,股动脉放血处死,取血浆置于-70℃冰箱用于检测生化指标,冰上迅速剥离胸主动脉,剥离血管外筋膜迅速投入液氮用于RNA的提取,少许迅速固定于2.5%和4%戊二醛中,用于扫描电镜和透射电镜观察超微结构的变化,剩余部分固定于10%福尔马林溶液中,用于HE染色和iNOS、NT免疫组化检测。
2、形态学观察:HE染色,iNOS、NT免疫组化染色及电镜(扫描和透描)。
3、血浆TNF-α和IL-1β,ET和TXB2,NO和iNOS,SOD和MDA等生化指标检测:TNF-α和IL-1β,ET和TXB2均采用放射免疫分析法,NO采用硝酸还原酶法,iNOS采用化学比色法,SOD采用黄嘌呤氧化酶法,MDA采用硫代巴比妥酸法均按试剂盒说明操作。
4、主动脉组织总RNA提取:用异硫氰酸胍一步法提取
5、mRNA表达的定量:用β-actin做内参,利用RT-PCR法测定主动脉iNOSmRNA。
结论:
1、STZ所致糖尿病大鼠主动脉的病理形态学变化和内皮功能异常与动脉粥样硬化最早期病变一致。
2、糖尿病大鼠主动脉内皮组织ONOO-表达量明显增加,内皮细胞线粒体破坏严重,提示ONOO-可能通过破坏线粒体结构导致糖尿病主动脉内皮损伤。
3、糖尿病大鼠血浆TNF-α、IL-1β含量增高,NO含量增多,同时主动脉内皮ONOO-含量明显增加,提示主动脉内皮组织损伤可能是通过TNF-α、IL-1β→NO→ONOO-氧化应激途径。
4、PBFNR治疗可抑制TNF-α、IL-1β、iNOS的表达,可减少或清除ONOO-的产生,符合多靶点相关集合作用,达到保护血管内皮完整性,防治糖尿病大血管病变的作用。而PBFNR在降低TNF-α、IL-1β,改善血管内皮功能方面,优于AG。