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恶性肿瘤是严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。恶性肿瘤的发生发展过程涉及表观遗传变异、细胞基因组不稳定性、癌基因和抑癌基因突变、免疫逃逸和肿瘤转移等多个因素和步骤,它们之间交互作用共同造成了恶性肿瘤的复杂性和多样性,给肿瘤治疗带来巨大挑战。手术、放射疗法、化学药物治疗虽然在早期的原发性肿瘤的根治上起到了一定的效果,但是仍然存在治疗不彻底,对于晚期以及转移的患者的治疗效果差等问题。靶向治疗在特定类型肿瘤治疗中取得了一定突破,但是仍然面临着诸多癌种无靶可用、易产生耐药等问题。近年来,以免疫检查点抑制剂为代表的肿瘤免疫疗法已经成为治疗癌症的新范式,靶向于PD-1/PD-L1信号通路的抗体已广泛用于具有高突变负荷肿瘤类型患者的临床治疗,并展示出持久的抗肿瘤效果。然而该疗法对所有肿瘤的客观应答率仅为20%-30%,大部分患者仍然无法从该治疗中获益。因此,依赖现有肿瘤免疫治疗药物还不能很好满足临床要求,难以实现对晚期肿瘤的有效控制,亟待开发新型高效的肿瘤创新药物及治疗策略。溶瘤病毒是一种具有天然溶瘤活性或基因工程改造的病毒,它们可以选择性对肿瘤细胞进行杀伤,释放出肿瘤相关抗原可以刺激机体产生抗肿瘤免疫应答。溶瘤病毒除了具有良好安全性、广谱的抗肿瘤活性和招募免疫细胞浸润等优点外,还具有可作为通用基因治疗载体的独特优势。携带外源治疗性基因的溶瘤病毒可以在肿瘤细胞中特异性的复制杀伤,同时表达外源治疗蛋白,增强对肿瘤的细胞毒性和免疫刺激活性,进而“重塑”肿瘤微环境;溶解肿瘤细胞释放肿瘤特异性抗原可触发先天性和适应性免疫应答,诱导机体产生免疫介导的针对局部肿瘤或远端转移肿瘤的清除。得益于溶瘤病毒通过多重机制共同发挥抗肿瘤治疗效果,溶瘤病毒免疫疗法已经成为肿瘤药物研发的热点。近年来,溶瘤病毒疗法已经在实验研究和临床研究中展现出一定的肿瘤治疗效果,但其疗效很大程度受到肿瘤免疫抑制性微环境和药物递送障碍等因素的限制,解决这些瓶颈问题有望为溶瘤病毒疗法带来新的突破。为了解决肿瘤免疫抑制性微环境对溶瘤病毒疗效的限制,本研究深入分析溶瘤病毒治疗后肿瘤微环境免疫特征变化,提出“溶瘤病毒+免疫检查点抗体”原位协同增效的治疗策略,在重组溶瘤病毒OVH的基础上,通过分子遗传学改造方法构建出重组表达PD-1单链抗体的新一代溶瘤病毒株OVH-aMPD-1。OVH-aMPD-1具有溶瘤病毒和免疫检查点抗体“双药合一,协同增效”的肿瘤免疫治疗效果。本研究还系统的阐明了 OVH-aMPD-1肿瘤治疗优势和潜在的免疫治疗机制。本研究第一部分,我们探究了在溶瘤病毒肿瘤治疗后,肿瘤免疫抑制性微环境对溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫应答的影响。我们首先在C57BL/6小鼠上建立Hepa1-6鼠肝癌双侧移植瘤模型,对单侧肿瘤进行溶瘤治疗后分析肿瘤治疗侧和远端侧肿瘤微环境的免疫细胞亚群变化情况。我们发现OVH治疗不仅能够显著促进CD4+T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞在肿瘤组织中浸润,还会上调肿瘤微环境中免疫抑制性分子PD-L1的表达。我们同时证实病毒诱导的Ⅰ型和Ⅱ型干扰素会诱导肿瘤细胞显著上调表达PD-L1,从而限制溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫应答。这提示我们直接靶向肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1抑制信号可能可以有效解决溶瘤病毒在发挥抗肿瘤免疫作用时容易受到肿瘤免疫抑制性微环境限制的问题。因此,我们提出利用溶瘤病毒在肿瘤内靶向递送PD-1免疫检查点抗体来改善肿瘤微环境,以期增强抗肿瘤免疫治疗效果的设想。本研究第二部分,我们在OVH基础上构建重组表达PD-1单链抗体（aMPD-1 scFv）基因的溶瘤病毒OVH-aMPD-1,并对OVH-aMPD-1进行表征和性质鉴定。利用我们前期建立的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的病毒重组技术,在OVH的基础上构建双拷贝eGFP基因被替换为aMPD-1 scFv基因的重组病毒OVH-aMPD-1。通过对OVH-aMPD-1的关键基因和蛋白的检测,我们发现病毒双拷贝eGFP基因被成功替换为aMPD-1 scFv基因。我们平行比较了OVH-aMPD-1与其母本毒株OVH的复制能力和肿瘤细胞杀伤能力。我们发现OVH-aMPD-1和OVH在肿瘤细胞中的复制能力和对肿瘤细胞的杀伤能力没有明显差异。OVH-aMPD-1感染多种人源和鼠源肿瘤细胞后不仅能杀伤细胞,还能够分泌表达aMPD-1 scFv。在小鼠移植瘤模型中,我们还发现OVH-aMPD-1能够特异性地在肿瘤内复制并分泌表达aMPD-1 scFv。上述研究结果表明利用溶瘤病毒OVH作为病毒载体能够高效地在肿瘤内递送外源治疗蛋白aMPD-1 scFv,获得的OVH-aMPD-1为本研究第三部分和第四部分中肿瘤治疗效果评估和治疗机制研究奠定实验基础。本研究第三部分,在多种双侧移植瘤模型中对OVH-aMPD-1的肿瘤治疗效果进行评估,同时对其免疫治疗机制进行深入探究。我们首先在小鼠肿瘤模型中比较了 OVH-aMPD-1和母本毒株OVH的肿瘤治疗效果,结果表明OVH-aMPD-1肿瘤控制效果显著优于OVH,OVH-aMPD-1治疗能实现更高的治愈率,治愈后的小鼠产生了针对接种肿瘤细胞的免疫记忆。我们进一步发现OVH-aMPD-1通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡和释放损伤相关分子模式（DAMPs）来发挥“肿瘤原位疫苗”作用,进而通过增强树突状细胞（DCs）对肿瘤细胞的吞噬以及对肿瘤抗原交叉提呈能力来促进T细胞的活化和浸润,从而改善肿瘤微环境和诱导机体产生更强的抗肿瘤免疫应答。对溶瘤病毒OVH-aMPD-1治疗导致的肿瘤微环境的变化情况进行分析,我们发现OVH-aMPD-1治疗能够显著促进CD155/TIGIT抑制信号在肿瘤微环境中上调表达,被募集的骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）细胞上CD155分子显著上调表达。我们推测CD155/TIGIT抑制信号可能是肿瘤微环境中限制OVH-aMPD-1诱导抗肿瘤免疫应答的潜在信号通路,OVH-aMPD-1治疗的同时解除CD155/TIGIT抑制信号可能实现更强的肿瘤治疗效果。本研究第四部分,在多种小鼠肿瘤模型中对OVH-aMPD-1和TIGIT抗体（Anti-TIGIT）联合治疗肿瘤的疗效进行评估,同时对两者联用的免疫治疗机制进行深入探究。我们利用小鼠侵袭性原位结直肠癌模型和小鼠晚期肝癌模型来评估OVH-aMPD-1和Anti-TIGIT联合治疗的效果,结果均表明OVH-aMPD-1联合Anti-TIGIT治疗能够有效抑制肿瘤的生长并显著延长荷瘤小鼠的生存期。OVH-aMPD-1治疗能够显著提高肿瘤对Anti-TIGIT治疗的敏感性,两者联合使用具有突出的协同治疗效果。为了探明两者联用的抗肿瘤免疫机制,我们首先利用T细胞阻断抗体来探究影响联合协同抗肿瘤效果的关键T细胞亚群,结果发现OVH-aMPD-1单药治疗或OVH-aMPD-1和Anti-TIGIT联合治疗介导的抗肿瘤免疫应答主要依赖于CD8+T细胞。我们利用负载卵白蛋白（OVA）肿瘤抗原的小鼠肝癌移植瘤模型来研究联合疗法介导的肿瘤特异性抗肿瘤免疫应答。结果发现,与OVH相比,OVH-aMPD-1可诱导机体产生显著增多的肿瘤特异性CD8+T细胞。与Anti-TIGIT联用,OVH-aMPD-1可进一步诱导机体产生更多的肿瘤特异性CD8+T细胞。上述研究表明OVH-aMPD-1能够进一步提高Anti-TIGIT肿瘤治疗的敏感性,诱导机体产生更为有效的系统性抗肿瘤免疫应答。综上所述,本研究通过对溶瘤病毒治疗后肿瘤微环境中限制溶瘤病毒肿瘤治疗效果的免疫学特征进行分析,发现溶瘤病毒治疗后可通过病毒诱导的I型和II型干扰素来上调肿瘤微环境中免疫抑制性分子PD-L1的表达。为了直接靶向肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1抑制信号,在溶瘤病毒OVH基础上构建出重组表达PD-1单链抗体的溶瘤病毒株OVH-aMPD-1,通过在肿瘤内靶向递送PD-1单链抗体来改善肿瘤微环境,以期增强抗肿瘤免疫治疗效果。重组表达PD-1单链抗体的溶瘤病毒能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡,释放DAMPs来提高DCs的抗原交叉提呈能力,并促进活化的T细胞在肿瘤中浸润,从而大幅改善肿瘤微环境。相较于OVH,OVH-aMPD-1对荷瘤小鼠具有更高的肿瘤治愈率。我们还发现OVH-aMPD-1治疗可促进MDSC细胞在肿瘤中浸润,被募集的MDSC细胞显著上调表达CD155分子,这提示溶瘤疗效可能受到肿瘤内CD155/TIGIT免疫抑制信号的影响。本研究进一步在模拟晚期肿瘤的侵袭性结肠癌模型中采用重组表达PD-1单链抗体的溶瘤病毒和TIGIT抗体联用的治疗策略,发现联合治疗能够通过诱导机体产生更强的、系统性的特异性抗肿瘤免疫反应来抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期。本研究所取得的结果为指导新型溶瘤病毒的升级改造、筛选协同增效药物和临床用药提供了新的思路,为重组表达PD-1单链抗体的溶瘤病毒药物运用于肿瘤临床治疗奠定了坚实的理论基础。