【摘 要】
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背景:长链非编码RNA（Long Non-Coding RNA,LNCRNAs）在多种人类肿瘤中表达异常,与肿瘤的发生发展密切相关。LNCRNAs在维持干细胞的自我更新和分化、调控干性相关基因的表达中也发挥着至关重要的作用。方法:1)用无血清三维立体悬浮培养富集乳腺癌干细胞后,采用荧光抗体标记干细胞表面的标志（CD44、CD24）,再利用流式细胞仪分选乳腺癌干细胞（Breast Cancer St
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背景:长链非编码RNA（Long Non-Coding RNA,LNCRNAs）在多种人类肿瘤中表达异常,与肿瘤的发生发展密切相关。LNCRNAs在维持干细胞的自我更新和分化、调控干性相关基因的表达中也发挥着至关重要的作用。方法:1)用无血清三维立体悬浮培养富集乳腺癌干细胞后,采用荧光抗体标记干细胞表面的标志（CD44、CD24）,再利用流式细胞仪分选乳腺癌干细胞（Breast Cancer Stem Cells,BCSCs）（CD44+/CD24-表型）和乳腺癌非干细胞（non-BCSCs）;免疫印迹法明确乳腺癌干细胞和非干细胞中的干性标志物（SOX2、ALDHA1、CD44、CD24）表达情况;2)采用人基因外显子1.0ST阵列进行全转录本芯片测序,生物信息分析乳腺癌干细胞和非干细胞差异表达LNCRNAs;q RT-PCR验证候选差异表达分子。3)采用GO分析和KEGG通路分析探究差异LNCRNAs的功能特征;STRING数据库进行蛋白相互作用网络模块分析,进一步筛选与肿瘤干性相关的核心LNCRNAs同时对其进行功能注解;通过癌症基因组图谱数据库（http://bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/GEM-requete.php）和GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）验证前期确定的核心LNCRNAs分子在三阴性乳腺癌患者临床样本中的差异表达情况,并进行临床生存分析。4)采用si RNA在乳腺癌细胞MCF-7中敲低LNCRNAs ZGRF1,研究敲低ZGRF1后乳腺癌细胞干性表型变化如CD44+/CD24-表型细胞比例、微球体形成能力以及克隆形成能力。结果:1)相比较贴壁培养细胞,微球体悬浮培养细胞可显著上调乳腺癌细胞干性标志物如CD44、SOX2和ALDHA1在蛋白和m RNA水平的表达,而下调CD24表达;通过分选得到乳腺癌干细胞和非干细胞进行基因芯片检测,发现乳腺癌干细胞相比较非乳腺癌干细胞具有143个显著异常表达的LNCRNAs（FC值≥2.50和P值≤0.050）,其中表达上调的有118个,表达下调的25个。2)生物信息分析显示差异表达的LNCRNAs主要参与RNA结合活性调节、翻译活性调节、核酸结合、剪接体复合体组成、线粒体蛋白复合体组成、内部线粒体、过氧化物酶体膜磷脂酰肌醇3激酶复合体组成部分、白介素6受体复合物和δDNA聚合酶复合物睫状神经营养因子受体复合物等生物学功能;进一步采用下游信号通路分析表明这些差异表达LNCRNAs主要聚类到六大关键信号通路,分别为RNA转运、剪接体、氧化磷酸化、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路和代谢途径。3)通过对三阴性乳腺癌肿瘤组织标本检测发现,ZGRF1、ETFA、RPL9、MFSD14C、ABCE1和CCT8在三阴性乳腺癌组织中的表达明显高于其他分子亚型如Luminal型、HER2阳性型,而ZGRF1（P=0.014,HR=1.4）、ETFA（P=0.022,HR=1.5）、ABCE1（P=0.022,HR=1.5）、CCT8（P=0.0018,HR=1.7）的表达增强与三阴性乳腺癌患者的预后呈显著负相关。4)采用si RNA敲低ZGRF1可导致乳腺癌细胞的微球体形成效率以及微球体大小均显著降低,伴随CD44+/CD24-细胞亚群比例减少;ZGRF1敲低同时可导致乳腺癌细胞克隆形成能力的减弱。结论:1)相比较已分化肿瘤细胞,乳腺癌干细胞的LNCRNAs表达谱具有显著差异。2)差异的LNCRNAs可通过与其他754个能编码蛋白的基因（PCG）相互作用发挥功能,通过RNA转运、剪接体、氧化磷酸化、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路和代谢途径调控肿瘤干细胞功能。3)ZGRF1是一潜在的乳腺癌干细胞干性调控分子,在乳腺癌干细胞中表达显著上调;在三阴性乳腺癌中表达水平高于其他亚型乳腺癌,且与患者的预后不良显著相关。4)干扰ZGRF1表达水平可导致乳腺癌细胞干性表型的变化。这些发现为我们理解LNCRNAs在乳腺癌细胞干性维持中调控功能提供了证据,也为靶向乳腺癌干细胞的个体化临床诊疗提供了研究新靶点。
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